DISCUSSIONE
Studi epidemiologici condotti recentemente hanno mostrato che i livelli circolanti delle forme solubili delle proteine transmembrana sono aumentati nelle patologie infiammatorie come l’aterosclerosi ed l’obesità [29] e sono correlati con la progressione e la gravità delle patologie cardiovascolari [38,39]. La produzione delle forme solubili di proteine transmembrana è un processo complesso che coinvolge, nella maggioranza dei casi, il sistema proteolitico di membrana che è regolato da una classe delle metalloprotesi della famiglia ADAM, in particolar modo da TACE/ADAM17, ADAM10 e ADAM12 e dal loro inibitore TIMP3 [40,41]. Studiando questo sistema in modelli murini, abbiamo riscontrato che una ridotta attività dell’inibitore delle metalloproteasi TIMP3 è correlata allo sviluppo di diabete ed infiammazione vascolare [14,23]. Recentemente Page e collaboratori hanno confermato in modelli animali che ridotti livelli di TIMP3 sono geneticamente correlati al diabete [24].
In un nostro precedente lavoro abbiamo osservato che una deficienza di TIMP3 è necessaria per lo sviluppo delle strie lipidiche caratterizzate dall’infiltrato macrofagico nel modello murino eterozigote per il recettore dell’insulina (Insr+/-
) alimentato con una dieta ricca in lipidi. L’importanza di
TIMP3 è dimostrata dal fenotipo invertito causato dalla deficienza di TACE nello stesso modello murino Insr+/-, suggerendo che la perdita di TIMP3 può favorire lo
sviluppo di lesioni aterosclerotiche [42]. Per caratterizzare completamente il ruolo di TIMP3 nella progressione della lesione aterosclerotica nel diabete sono necessari studi in altri modelli murini, quali ad esempio i topi knockout per ApoE e per il recettore delle LDL.
Partendo da queste premesse, abbiamo ipotizzato che il sistema proteolitico di membrana possa essere coinvolto nella patogenesi del diabete di
tipo 2 e dell’aterosclerosi. Per verificare questa nostra ipotesi abbiamo studiato inizialmente l’attività del sistema proteolitico di membrana in tre coorti di soggetti caratterizzati da differente localizzazione delle lesioni aterosclerotiche ed insulino resistenza. I nostri risultati suggeriscono che livelli crescenti delle molecole solubili di membrana circolanti sono associate con un peggioramento dell’insulino resistenza, del metabolismo glucidico e lipidico e del processo aterosclerotico. Inoltre in presenza di alterazioni del metabolismo glucidico, come la presenza di elevati livelli di glicemia a digiuno o di glicemia 2 ore dopo il carico, abbiamo riscontrato elevati livelli di alcuni dei substrati solubili, e in particolare di sICAM1, sVCAM1.
Nell’uomo non è stata mai analizzata direttamente l’attivazione del sistema proteolitico di membrana nei tessuti metabolici e vascolari. Abbiamo quindi deciso di analizzare placche aterosclerotiche prelevate da pazienti diabetici e non diabetici al fine di valutare l’attività del sistema.
I nostri risultati suggeriscono che le placche aterosclerotiche dei pazienti diabetici mostrano una riduzione dei livelli di espressione di TIMP3, con una conseguente aumentata attività di TACE/ADAM17 e delle MMP9, probabilmente causata dall’iperglicemia, che è stata precedentemete riconosciuta come fattore attivante entrambi gli enzimi mediante un meccanismo PKC-dipendente [12,43,44,45]. Inoltre i nostri dati suggeriscono che la riduzione dei livelli di espressione di TIMP3, determinata da fattori metabolici, può aumentare l’attività di enzimi infiammatori e proteolitici, che possono svolgere un ruolo nel processo di aterotrombosi [46,26].
Uno studio pubblicato da Libby e collaboratori ha mostrato che l’espressione di TIMP3 è aumentata in estratti di ateromi rispetto a tessuto non aterosclerotico in soggetti non diabetici [47]. Alla luce dei nostri risultati, la riduzione di TIMP3 può essere considerata come un fattore specifico nel processo aterosclerotico dei pazienti diabetici.
La diminuita azione di TIMP3 può determinare un incremento del segnale del TNF-α e del recettore del fattore epidermico di crescita (Epidermal Growth Factor Receptor o EGFR), aumentando potenzialmente la carica infiammatoria
comporta un aumento dell’attività delle MMP9 nelle placche aterosclerotiche, che è una ben nota caratteristica del sistema vascolare dei soggetti con diabete mellito di tipo 2 [48], e può alterare la stabilità del placca a lungo termine.
Il ruolo dei TIMP nel processo di aterotrombosi del soggetto diabetico è ancora poco chiaro. Dati recenti da modelli animali suggeriscono che un alterato rapporto fra le metalloproteasi e gli inibitori TIMP possa favorire un incremento della degradazione della matrice extracellulare in grado di promuovere la progressione del processo aterosclerotico [49].
I fattori che regolano l’espressione dei vari TIMP nelle placche aterosclerotiche sono ancora indefiniti, sebbene dati dalla letteratura suggeriscano che possano essere implicati fattori di crescita quali TGF-β e PDGF [49]. Nonostante ciò il ruolo e la regolazione di TIMP3 nella patologia vascolare dei pazienti diabetici non è mai stata indagata. I nostri dati mostrano che i livelli di espressione di TIMP3 nelle placche aterosclerotiche sono negativamente associati alle concentrazioni plasmatiche del colesterolo totale e dell’emoglobina glicata. L’esposizione delle CASMC a vari stimoli correlati alla glucotossicità e alla lipotossicità ha evidenziato che sia l’alto glucosio che inibizione della deacetilasi SirT1 determinano una riduzione dell’espressione e dell’attività di TIMP3.
Numerose evidenze ottenute negli ultimi anni stanno facendo emergere SirT1 come regolatore chiave di risposte metaboliche integrate alla disponibilità di nutrienti [31-34,50]. Dati ottenuti nei topi knockout per il gene ApoE suggeriscono che una sovra-espressione di SirT1 nelle cellule endoteliali può rappresentare un fattore protettivo nella progressione del processo aterosclerotico, sebbene i meccanismi alla base sono ancora poco definiti.
Nel nostro lavoro, attraverso il silenziamento genico o la sovra-espressione di SirT1, evidenziamo il ruolo della deacetilasi SirT1 nella modulazione dell’espressione di TIMP3 nelle cellule muscolari lisce ed nel sistema monocita- macrofagico. SirT1 controlla l’espressione genica mediante la deacetilazione di istoni e fattori di trascrizione: uno od entrambi i meccanismi potrebbero essere coinvolti nella regolazione dell’espressione di TIMP3.
Precedenti studi hanno mostrato che un agonista del fattore di trascrizione LXR, il composto T0901317, è in grado di regolare l’espressione di TIMP3. Nei
nostri sistemi cellulari non abbiamo osservato alcun effetto di T0901317 sull’espressione genica: questo potrebbe dipendere da numerosi fattori fra cui l’utilizzo di modelli sperimentali differenti e diverse condizioni di coltura. Inoltre SirT1 è un regolatore positivo di LXR, così come di altri fattori di trascrizione potenzialmente coinvolti nell’espressione di TIMP3, quale ad esempio FoxO1 [50,51].
Con i nostri risultati abbiamo inoltre evidenziato che la sovra-espressione di SirT1 è in grado di normalizzare l’espressione di TIMP3 in presenza di glucotossicità, ed è quindi speculabile che SirT1 moduli gli eventi correlati alla de-repressione del promotore di TIMP3 attraverso la deacetilazione di fattori di trascrizione come FoxO1 o di istoni.
In letteratura, fino ad oggi, questo è il primo gene/meccanismo correlato a SirT1 identificato nel contesto del diabete e della patologia aterosclerotica utilizzando campioni di tessuto vascolare umano. I nostri risultati inoltre avvalorano la teoria in cui SirT1 riveste un ruolo protettivo nelle malattie metaboliche.