Obesi (n = 20) Controlli (n = 20)
Età (anni) 37.3 11.4 35.0 8.2
Maschi/Femmine 10/10 11/9
Indice di Massa Corporea
(Kg/m2)
45.3 6.0 * 26.3 2.4
Glicemia a digiuno (mg/dL) 90.5 5.9 83.5 8.0 eGFR (ml/min) 91.5 7.9 87.0 5.7
Storia di fumo no no
Pressione arteriosa sistolica (mmHg) 119.4 8.1 125.8 7.1 Pressione arteriosa diastolica (mmHg) 79.1 5.8 78.5 3.7 Frequenza cardiaca (bpm) 78.9 7.1 * 68.3 4.9 Colesterolo totale (mg/dL) 183 25 194 21 Colesterolo HDL (mg/dL) 44 10 51 7 Trigliceridi (mg/dL) 123 34 131 24 * P<0.05 vs controlli
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Preparazione delle piccole arterie ed esperimenti funzionali
Tutti i pazienti sono stati sottoposti durante intervento chirurgico in laparoscopia a biopsia del grasso sottocutaneo dalla parete anteriore della regione addominale, dal quale sono state isolate le piccole arterie (150-300 µm di diametro) dal grasso periavventiziale.
Il tessuto prelevato dalla biopsia è immerso immediatamente in una soluzione di Krebs ( mM: NaHCO3 25.0; Glucosio 5.5; NaCl 120.0; KCL 4.7; CaCl2 2.5; EDTA 0.026; KH2PO4 1.18) a 4°C per mantenerlo vitale. In seguito viene posizionato su una piastra di Petri, all’interno della quale, tramite l’ausilio del microscopio ottico bifocale e di pinzette molto sottili, viene effettuato l’isolamento delle piccole arterie dal grasso periavventiziale; queste arterie vengono quindi posizionate in una apposita camera riscaldata a 37 °C contenente Krebs, dove vengono inserite e legate tramite un filo di seta alle due estremità di due microcannule di vetro. La posizione del vaso è quindi ottimizzata mediante piccoli movimenti di una delle due microcannule fino a rendere parallele le due pareti del vaso. All’interno della camera il vaso è mantenuto vitale durante tutto l’esperimento perchè al suo interno viene fatta passare la soluzione di Krebs saturata di carbogeno (miscela contenente ossigeno al 95% e anidride carbonica al 5%) a un PH di 7.4 e a una temperatura fisiologica di 37 °C. Gli studi sono stati eseguiti mantenendo il vaso ad una pressione costante di 60mmHg. Con l’ausilio di un microscopio ottico e di una telecamera collegata al monitor del computer è stato possibile vedere ad occhio nudo e in diretta nel monitor la vasodilatazione o vasocostrizione dell’arteria isolata. L’entità del movimento del vaso è stata calcolata direttamente dal programma Myoview ed espressa in micron. Le/a sostanze/a da testare sono state infuse nel lato
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extraluminare dell’arteria tramite una pompa peristaltica. Questa pompa lavora a flusso costante (circa 4ml/min).
Prima di iniziare il trattamento con la/e sostanze in esame, una volta finito l’allestimento è stata valutata la vitalità dell’arteria. A tale fine, l’arteria è stata trattata, tramite infusione extraluminale, con una soluzione contenente una elevata concentrazione di KCl (125mmol/L). Le arterie vengono considerate vitali se mostrano una riduzione del lume maggiore del 40%. Una volta appurato che l’arteria allestita è vitale, è stata lavata per 30 min con Krebs e successivamente sono state effettuate misurazioni basali del lume e delle parete del vaso.
Test di reattività vascolare
Valutazione della vasodilatazione endotelio-dipendente ed endotelio-indipendente
Previa contrazione indotta con Norepinefrina (1µM), sono state valutate le dilatazioni endotelio-dipendenti ed endotelio-indipendenti misurando rispettivamente la risposta dilatatoria delle piccole arterie a concentrazioni cumulative di Acetilcolina (ACh da 0,001 a 100 µM) e a Nitroprussiato di Sodio (0,01-100 µM).
Influenza della biodisponibilità di NO sulla dilatazione endotelio-dipendente
Nelle piccole arterie dei pazienti obesi e dei soggetti normopeso di controllo sono state realizzate curve concentrazione-risposta all’ACh prima e dopo incubazione per 30 minuti con un inibitore di eNOS, L-NAME (10-4mol/L), per valutare la biodisponibilità di NO.
45 Valutazione del ruolo di L-arginina
Esclusivamente nelle piccole arterie dei pazienti obesi sono state realizzate curve concentrazione-risposta all’ACh prima e dopo incubazione per 30 minuti con L- arginina (3mmol/L) al fine di capire se la supplementazione del substrato di eNOS porti o meno ad un miglioramento della vasodilatazione endotelio-dipendente.
Valutazione del ruolo di Arginasi
Nelle piccole arterie di resistenza dei pazienti obesi e dei soggetti controllo, sono state realizzate curve concentrazione-risposta all’ACh prima e dopo incubazione per 30 minuti con un inibitore non selettivo di Arginasi, norNOHA (10µmol/L) per osservare il comportamento dei vasi in funzione del blocco dell’enzima Arginasi.
Rilevazione della produzione di anione superossido intravascolare
La produzione in situ dell’anione superossido è stata valutata mediante la colorazione fluorescente con dihydroethidum (DHE) in condizioni basali.
Sono state quindi applicate soluzioni tampone Krebs-HEPES contenenti 2 µM di DHE su ciascuna sezione e valutate con microscopio a fluorescenza.
La percentuale di area di parete arteriosa colorata con segnale rosso è stata analizzata con un software di imaging (MKcBiophotonics Image J; National Institute of Health, Bethesda, MD).
46 Analisi statistica dei dati
L’analisi statistica è stata effettuata utilizzando il software GraphPad Prism (GraphPad Prism, San Diego, CA, USA). I risultati sono presentati come media deviazione standard e sono stati analizzati mediante ANOVA per misure ripetute, seguito dal test di Student-Newman-Keuls, o dal t test di Student per dati non appaiati. È stato considerato statisticamente significativo il valore di p < 0.05.
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5.
RISULTATI
Studi di funzionalità vascolare
I primi risultati hanno riguardato la funzione endoteliale dei vasi provenienti dai pazienti obesi e dai controlli, considerati globalmente, senza distinzione di età.
Nei controlli, la somministrazione di concentrazioni crescenti di ACh determinava una normale vasodilatazione, prossima al 100%, che veniva significativamente ridotta dalla concomitante somministrazione di L-NAME. In questo gruppo, norNOHA non modificava in alcun modo la risposta vascolare all’ACh. Infine la concomitante infusione di norNOHA non influenzava l’effetto inibitorio di L- NAME sulla vasodilatazione endotelio-dipendente (Fig. 6A).
Nei pazienti obesi, la somministrazione di concentrazioni crescenti di ACh provocava una vasodilatazione che è risultata significativamente (P<0.001) ridotta rispetto ai controlli. Inoltre, l’inibizione di L-NAME sulla risposta all’ACh, seppur ancora presente, era decisamente ridotta rispetto a quella osservata nei soggetti controllo. In questi vasi inoltre l’inibizione di Arginasi, mediante norNOHA, determinava un modesto aumento della vasodilatazione endotelio-dipendente, seppure statisticamente significativo. NorNOHA inoltre aumentava l’effetto inibitorio di L-NAME sulla vasodilatazione ACh-indotta. Da osservare che in presenza di norNOHA l’effetto inibitorio di L-NAME è risultato comunque inferiore rispetto a quello osservato nei controlli (Fig. 6B).
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A)
B)
Figura 6. Studi di funzionalità vascolare in soggetti normopeso di controllo (A) e in pazienti con obesità (B).
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Successivamente, abbiamo osservato le stesse curve, suddividendo sia i soggetti normopeso di controllo sia i pazienti con obesità in funzione dell’età.
Nei controlli di età inferiore a 30 anni, la somministrazione di ACh induceva una importante vasodilatazione (>90%) e la incubazione con norNOHA non esercitava alcuna influenza sulla dilatazione endotelio-dipendente; al contrario, la vasodilatazione è risultata significativamente ridotta in presenza di L-NAME, indipendentemente dalla presenza di norNOHA (Fig. 7A).
Nei pazienti obesi di età inferiore a 30 anni, la somministrazione di ACh induceva una minore risposta vasodilatante rispetto ai controlli di pari età, e tale risposta veniva significativamente potenziata dalla contemporanea somministrazione di norNOHA, la quale è stata anche in grado di aumentare significativamente la inibizione indotta da L-NAME sull’ACh, risultando simile a quella osservata nei controlli. In questo gruppo l’infusione di L-arginina non modificava la risposta vascolare all’agonista endoteliale, mentre in presenza di entrambe norNOHA ed L- arginina, la vasodilatazione Ach-mediata veniva ulteriormente potenziata. Nei controlli di età maggiore di 30 anni, la somministrazione di ACh determinava una vasodilatazione minore rispetto ai controlli di età inferiore a 30 anni (circa il 70%). Anche in questo gruppo di controlli, l’incubazione con norNOHA non ha esercitato nessuna influenza sulla risposta vascolare, mentre la somministrazione di L-NAME riduceva significativamente la risposta all’Ach, anche se in misura ridotta rispetto ai controlli più giovani (P<0.05), indipendentemente dalla presenza di norNOHA (Fig.
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Soggetti di controllo (n=8) (età: 26.3±2.2) A)
Pazienti obesi (n=8) (età:26.2±3.0)
B)
Figura 7. Studi di funzionalità vascolare in soggetti normopeso di controllo (A) e in pazienti obesi (B) di età inferiore a 30 anni.
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Nei pazienti obesi di età superiore a 30 anni, la risposta all’Ach risultava ulteriormente ridotta sia rispetto ai pazienti obesi più giovani (P<0.001) che ai soggetti controllo di pari età (Fig. 8A). In questo gruppo, nè la presenza di norNOHA, né quella di L-NAME influenzava in alcun modo la risposta vascolare all’agonista endoteliale. Nell’esperimento finale, L-Arginina si è dimostrata anch’essa ininfluente sulla vasodilatazione endotelio-dipendente, così come la concomitante infusione di norNOHA (Fig. 8B).
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Soggetti di controllo (n=12) (età: 40.8±4.6)
A)
Pazienti obesi (n=12) (età: 44.7±8.2)
B)
Figura 8. Studi di funzionalità vascolare in soggetti normopeso di controllo (A) e in pazienti obesi (B) di età superiore a 30 anni.
53 Analisi della produzione di anione superossido
L’analisi DHE mostrava un notevole aumento della produzione di anione superossido nei vasi dei pazienti più anziani con obesità severa, sia rispetto a quelli dei controlli di ogni età, sia rispetto a quelli dei pazienti obesi più giovani.
Figura 8. In alto, immagine di immunofluorescenza rappresentativa dell’espressione di ROS nei vasi dei soggetti normopeso di controllo e nei vasi dei pazienti con obesità severa, suddivisi per fasce di età. In basso, analisi quantitativa del segnale rosso nelle piccole arterie dei soggetti normopeso di controllo e nelle piccole arterie di pazienti con obesità severa.
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6
. DISCUSSIONE
I risultati ottenuti evidenziano che a livello delle piccole arterie di resistenza del paziente con obesità di grado severo esiste una compromissione della vasodilatazione endotelio-dipendente ed una concomitante riduzione dell’effetto inibitorio svolto da un NOS antagonista sulla funzione endoteliale. Questi dati confermano i risultati presenti in letteratura che dimostrano come nelle piccole arterie di resistenza dei pazienti con obesità severa sia presente una disfunzione endoteliale legata ad una ridotta biodisponibilità di NO.
La prima novità dei risultati della presente tesi consiste nell’individuazione del ruolo dell’enzima Arginasi nella patogenesi della disfunzione endoteliale nei pazienti obesi. I nostri risultati dimostrano che nelle piccole arterie di resistenza dei pazienti obesi di età inferiore a 30 anni la ridotta risposta vascolare all’ACh veniva significativamente migliorata dalla incubazione con norNOHA, un inibitore di Arginasi. In aggiunta a ciò, in presenza di norNOHA, l’effetto inibitorio di L- NAME sulla risposta vascolare all’acetilcolina veniva ripristinato, un dato che dimostra come il blocco di Arginasi sia in grado di aumentare significativamente la biodisponibilità del substrato L-arginina per eNOS, per produrre NO. Ciò sta ad indicare che in questa coorte di pazienti, esiste effettivamente una aumentata attività arginasica che è responsabile della ridotta vasodilatazione endotelio-dipendente. Inoltre, a rendere ancora più solida questa evidenza, sempre nei pazienti obesi di età inferiore a 30 anni, la sola somministrazione del substrato L-arginina non produceva alcun effetto, mentre la co-somministrazione del substrato e della norNOHA
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aumentava ulteriormente la risposta vasodilatante all’ACh (rispetto alla sola somministrazione di norNOHA); ciò sta ad indicare che se aumentiamo il substrato ma non inibiamo l’Arginasi, quest’ultima, che evidentemente ha una maggiore affinità di legame con L-Arginina rispetto a eNOS con cui svolge un meccanismo di competizione enzimatica, persevera nella sua azione di impedire al substrato di essere utilizzato dalla eNOS.
La seconda novità dei risultati della presente tesi consiste nell’individuazione del ruolo dell’enzima Arginasi nella patogenesi della disfunzione endoteliale nei pazienti obesi più anziani. I nostri risultati hanno innanzitutto dimostrato che nelle piccole arterie di resistenza dei pazienti obesi di età maggiore a 30 anni, la ridotta risposta vascolare all’ACh non veniva influenzata dalla simultanea somministrazione di L-NAME, a conferma del dato che in questi pazienti la biodisponibilità di NO è pressochè esaurita. Inoltre, la risposta all’acetilcolina non veniva influenzata né dalla incubazione della sola norNOHA, né dalla somministrazione del solo substrato L-arginina, né dalla coincubazione con L- arginina e norNOHA. Questi dati, nel loro insieme stanno ad indicare che Arginasi non ha alcun ruolo nella patogenesi della disfunzione endoteliale del paziente obeso più anziano e che anche eNOS ha perso la sua funzione di generare NO, come dimostrato dall’ininfluenza sia della somministrazione di L-NAME che della cosomministrazione di norNOHA e L-arginina. Una possibile spiegazione di questo dato viene fornita dai nostri risultati sullo stress ossidativo attraverso la tecnica del diidroetidio mediante l’ausilio del microscopio confocale, che consente di individuare la presenza di anione superossido all’interno della parete vascolare. Questa analisi ha evidenziato la presenza di una notevole quantità di stress
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ossidativo all’interno dei vasi provenienti dai pazienti obesi più anziani, significativamente maggiore sia rispetto ai controlli di pari età, sia rispetto ai pazienti obesi più giovani. Ciò ci induce a concludere che nei pazienti obesi più anziani, la mancata funzionalità sia di NOS che di Arginasi nel modificare la risposta all’agonista endoteliale sia la conseguenza proprio di un elevato livello di stress ossidativo che verosimilmente (anche se non ancora dimostrato da questo studio) determina il fenomeno di disaccoppiamento della eNOS. E’ noto infatti che lo stress ossidativo abbia una elevatissima affinità per eNOS, tale da modificarne la funzione e indurlo a produrre perossinitriti a scapito dell’NO. Se questa ipotesi è plausibile, è verosimile che nel nostro studio la somministrazione di sostanze antiossidanti come l’acido ascorbico, annullando lo stress ossidativo, potrebbe essere in grado di ripristinare la funzione endoteliale dopo infusione di norNOHA.
In conclusione, i nostri risultati indicano che all’interno delle piccole arterie di resistenza dei pazienti obesi più giovani, Arginasi è presente e funzionante, in grado di sottrarre L-arginina ad eNOS ed impedendo così la genesi di una rilevante quota di NO. Al contrario, nei pazienti obesi più anziani o comunque con una maggiore esposizione all’obesità severa, Arginasi non sembra giocare nessun ruolo nel determinismo della disfunzione endoteliale.
Questi dati hanno un potenziale risvolto clinico. E’ oramai infatti definito come la ridotta attività biologica di NO sia fondamentale nella patogenesi della malattia aterosclerotica e negli eventi cardiovascolari. Pertanto, l’azione dannosa di Arginasi sull’attività del NO nei pazienti obesi più giovani può rappresentare un meccanismo
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attraverso il quale possano essere favoriti i processi aterosclerotici, come documentato in modelli animali ed umani di malattie vascolari.
I presenti risultati suggeriscono anche che la via enzimatica mediata da Arginasi potrà in futuro essere considerata un possibile target terapeutico aggiuntivo per migliorare la disfunzione endoteliale e, possibilmente, per prevenire lo sviluppo di malattie cardiovascolari nei giovani pazienti con obesità severa.
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8. RINRAZIAMENTI
Desidero ringraziare innanzitutto il Professor Agostino Virdis per la grande disponibilità, gentilezza e professionalità con cui mi ha seguito in questi mesi di preparazione della tesi. Spero di tutto cuore che la nostra collaborazione possa proseguire in futuro, in quanto ho ancora moltissimo da imparare dalla sua conoscenza ed esperienza.
Un sentito grazie è rivolto in particolare ad Emiliano che ha dato un contributo indispensabile allo svolgimento dei nostri esperimenti e con cui si è instaurato da subito un rapporto di amicizia.
Ringrazio la mia famiglia, che mi ha supportato e sopportato per tutti questi anni. In particolare ringrazio mio padre che mi ha sempre aiutato nell’ultimo ripasso prima degli esami (sperando che un po’ sia servito anche a lui!), mia mamma che mi ha sempre pazientemente spronato a non accontentarmi e a dare sempre il massimo, mio fratello che è sempre stato presente sin da quando eravamo piccoli. Un ringraziamento speciale va anche ai miei nonni Liliana, Ugo e Fernando, alla zia Mariateresa e alla zia Miranda.
Per ultimi, ma non ultimi ringrazio i miei amici, quelli storici che conosco sin da quando ero in fasce, quelli conosciuti prima tra i banchi di scuola e poi dell’università. Ciascuno a modo suo ha saputo darmi molto e spero che la nostra amicizia rimarrà anche negli anni futuri.
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