Caratteristiche degli stadi intermedi: il molten globule

L'interesse mostrato verso stati parzialmente strutturati delle proteine, dei quali il più importante è certamente il molten globule, deriva dal fatto che essi rappresentano dei buoni modelli per descrivere le proprietà di intermedi transienti nel processo di folding delle proteine. Il molten globule può essere ottenuto in condizioni di blanda denaturazione delle proteine; in alcuni casi le sue proprietà sono assai simili a quelle di intermedi cinetici di folding . L'interesse verso gli stati parzialmente strutturati delle proteine deriva anche dal fatto che tali stati vengono adottati dalle macromolecole per svolgere alcune funzioni a livello cellulare (come il legame con ligandi, o la traslocazione di proteine). Sembra anche che, il molten globule sia implicato nel misfolding e nell’ aggregazione delle proteine. L'aggregazione proteica rappresenta un notevole problema, sia nell’ area biotecnologica, (basti pensare, ad esempio ala conservazione e somministrazione di farmaci proteici), che nell’area clinica, in gravi malattie denominate amiloidosi (Alzheimer, malattie prioniche). Recenti studi hanno infatti dimostrato che il molten globule è implicato nel meccanismo del associazione/aggregazione di proteine. L'aggregazione viene probabilmente determinata da interazioni intermolecolari fra zone idrofobiche degli intermedi di folding delle

catena polipeptidica, ma i gruppi idrofobici sono compattati in ampie zone che interagendo, favoriscono il processo di aggregazione. ! Lo studio della struttura e dei meccanismi che portano alla formazione del molten globule ricopre importanza nell'ambito della ricerca sulle proteine, con prevedibili ricadute nella ricerca di base (folding e funzione di proteine), nelle biotecnologie (corpi di inclusione), nell’ industria farmaceutica (formulazione di farmaci proteici) e in campo clinico (amiloidosi). Purtroppo, lo studio strutturale delle specie intermedie nel processo di folding è complicato dalla natura transiente che richiede l’uso di tecniche di cinetica rapida (stop-flow); tali difficoltà hanno favorito lo studio del molten globule in condizioni di equilibrio. E’ stato osservato sperimentalmente che le caratteristiche degli intermedi di equilibrio sono abbastanza correlabili a quelle degli intermedi cinetici; il molten globule, quindi, è stato ampiamente utilizzato come sistema modello per lo studio del folding e dell'aggregazione di proteine. D'altra parte, la specifica struttura tridimensionale del molten globule, non è nota dal momento che non può essere determinata mediante studi di cristallografia. Le tecniche più usate per l'analisi conformazionale del molten globule sono il dicroismo circolare, la fluorescenza di emissione, la spettroscopia Raman, lo scattering di raggi X in soluzione, la microcalorimetria, e in particolare, l’ NMR bidimensionale accoppiato a misure di scambio di idrogeno. Una recente tecnica utilizzata per l'analisi strutturale del molten globule è la proteolisi limitata, un approccio che ha suscitato negli ultimi anni un evidente interesse nell'ambito delle ricerche sulle proteine perché semplice, affidabile e in grado di trarre vantaggio dai recenti e spettacolari sviluppi della spettrometria di massa (MS) nell’analisi di frammenti proteici. Tale tecnica si basa sul concetto che la proteolisi avviene a livello dei siti flessibili di una proteina e pertanto può essere utilizzata per l'analisi della struttura e della dinamica di sistemi proteici. Questa tecnica richiede minime quantità di sostanza (anche pochi microgrammi) e permette di superare molte difficoltà che non sono invece risolvibili con le tecniche di uso più comune (spettroscopia o cristallografia).

Oggetto specifico di studio sono stati gli intermedi di proteine modello quali l’apomioglobina (apoMb) e l’ alfa-lattalbumina (LA). Lo stato di molten globule dell’alfa-lattalbumina più studiato (123-residui, quattro ponti disolfuro) è quello ottenuto in condizioni acide ( pH 2), e denominato stato A. È stato dimostrato che la pepsina inizialmente idrolizza la LA in ambiente acido a livello del dominio beta (regione 35-57), evidenziando questa regione come flessibile e /o denaturata nelle condizioni studiate. Questi risultati sono in accordo con quelli ottenuti mediante misure NMR.

Lo stato di molten globule di LA può essere ottenuto anche a pH neutro, rimuovendo lo ione calcio della metallo-proteina mediante EDTA. Le caratteristiche conformazionali dell'apo-proteina sono state studiate mediante esperimenti di proteolisi con proteinasi K, che è attiva a pH neutro e ha una specificità di substrato molto ampia. Ulteriore scopo di questi studi è stato la purificazione di frammenti proteici di LA (e/o di specie proteiche nickel/ troncate), caratterizzati attraverso tecniche spettroscopiche. Lo stato di molten globule dell’apomioglobina è un utile modello per studiare sia aspetti strutturali e dinamici di proteine, sia alcuni aspetti del processo di folding. La struttura tridimensionale dell’ apoMb estratta dal cuore di cavallo (153- residui, nessun ponte disolfuro) è molto simile a quella della forma olo della proteina. Le differenze strutturali tra olo e apoMb sono localizzate principalmente a livello dell’elica F (residui 89-96), che è selettivamente attaccata da varie proteasi. Da studi NMR, è emerso che la apoMb è ben strutturata, sebbene l’elica F risulta mobile. Stati parzialmente strutturati di apoMb possono essere ottenuti esponendo la proteina a pH 2.0 o 4.0; inoltre, l'aggiunta di sali (ad esempio tricloroacetato) favorisce la formazione del molten globule. L’utilizzo dei frammenti nello studio di folding delle proteine è di grande interesse in quanto essi sono, se isolati, assai poco strutturati. La loro strutturazione può fornire informazioni sulle specifiche interazioni terziarie che si instaurano al momento del “binding” tra due diversi frammenti. Lo stato nativo di una proteina è uno stato compatto e relativamente rigido in cui la maggior parte degli atomi risultano più o meno bloccati da interazioni intramolecolari. Lo stato completamente denaturato rappresenta uno stato assai meno definito, in cui la proteina è priva di struttura secondaria e terziaria e può presentare un ampio numero di conformazioni a seconda del solvente usato o della temperatura. La denaturazione indotta o dalla temperatura o da agenti chimici come la Gdn- HCl o l’urea, rappresenta un passaggio da uno stato molto ordinato a uno disordinato, come dimostrato dall’aumento dell’entropia, entalpia e calore specifico che accompagna il processo.

Gli stati intermedi si differenziano sia dalla forma nativa, essendo

caratterizzati dalla struttura terziaria più fluttuante, sia dallo stato denaturato, dal momento che posseggono regioni a struttura secondaria simile allo stato nativo. Una delle più importanti proprietà fisiche del molten globule è di

Baldwin, 1991), Durante il processo di folding le proteine vanno da uno stato ad alta energia (stato unfolded) ad uno a bassa energia (stato folded) ed il molten globule si colloca in una buca energetica compresa tra i due stati. Paradossalmente lo stato maturo può non essere estremamente vantaggioso dal punto di vista termodinamico, ma può esserlo dal punto di vista cinetico. Il volume del molten globule è circa il 50% rispetto a quello osservato nella forma nativa. Ciò suggerisce la possibilità che le molecole d’acqua possano penetrare all’interno della macromolecola, provocando così un forte indebolimento delle forze di attrazione di Van der Waals. La variazione del calore specifico della proteina che accompagna il processo di denaturazione, riflette principalmente l’ esposizione al solvente acquoso delle regioni non polari della catena polipeptidica. L’ incremento del calore specifico del molten globule rispetto alla forma nativa dimostra che alcuni gruppi non polari sono meno fortemente impacchettati e quindi maggiormente esposti al solvente. Queste considerazioni hanno portato a suggerire che il molten globule possa essere stabilizzato principalmente da interazioni idrofobiche dei gruppi non polari, che rifuggono il mezzo acquoso.