Dei ceppi di P. fluorescens utilizzati nel presente lavoro di tesi è stata caratterizzata la secrezione di molecole bioattive nel mezzo extracellulare analizzando le proprietà dei brodi colturali dopo 72 ore di incubazione. Un ml di una coltura starter overnight in King’s B è stata inoculata in 50 ml di MMU con glucosio in beute da 250 ml. Le colture sono state incubate a 28°C a 180 rpm per 72 ore e trascorso questo tempo ne è stata valutata l’assorbanza (OD600) al fine di normalizzare i risultati in funzione della biomassa batterica. Allo scopo di verificare la presenza di biomolecole fluorescenti tra cui la pioverdina, le colture batteriche sono state centrifugate a 8.000 rpm per 10 min e il sovranatante filtro-sterilizzato a 0,22 µm mediante l’utilizzo di appartati da filtrazione sotto vuoto (Nalgene, Rapid Flow Filter). Dei brodi di coltura ottenuti è stato misurato il pH e l’assorbanza a 400 nm allo scopo di stimare la concentrazione di pioverdina (Hoegy et al., 2014).
Valutazione della capacità chelante dei brodi colturali batterici
Dei brodi colturali batterci è stata valutata la capacità chelante mediante saggio CAS, analizzando spettrofotometricamente le variazioni colorimetriche del reagente Chromeazurol. Il test è stato condotto in piastre multiwell da 96 pozzetti, in ogni pozzetto sono stati aggiunti 112 µl di acqua bidistillata, 50 µl di reagente CAS e 38 µl di brodo di coltura. L’assorbanza è stata misurata a 655 nm (OD655) (Microplate Reader, Biorad) ad intervalli regolari di 5 minuti per la prima ora di reazione e successivamente al 75° minuto e 135° minuto. Nella prova è stata inserita una tesi di controllo negativo sostituendo in reazione il brodo di coltura batterico con il substrato di crescita MMU ed una di controllo positivo utilizzando una soluzione 1 mM di EDTA (Pérez-Miranda et al., 2007).
58 La capacità chelante dei campioni è stata espressa come decremento percentuale della OD655, utilizzando la seguente formula:
CC %= [(ODc-ODt)/ODc]x100 Dove:
ODc = OD a 655 nm del controllo negativo; ODt = OD a 655 nm del campione saggiato.
Per ogni ceppo batterico sono state effettuate tre repliche biologiche e otto repliche tecniche, l’esperimento è stato ripetuto tre volte. Dei brodi di coltura batterici è stata analizzata la capacità chelante valutando la quantità in FeCl3 capace di neutralizzare le cariche chelanti presenti. A tale scopo aliquote dei brodi colturali dei ceppi mutanti di P. fluorescens CHA1196 e CHA1242 sono state trattate con concentrazioni crescenti di FeCl3 (0-0,01-0,02- 0,05-0,1-0,2-0,5-1-2-5 mM) agitate vigorosamente per 5 minuti e lasciate a temperatura ambiente per un’ora. Dei brodi di coltura così trattati è stata analizzata la capacità chelante residua mediante saggio CAS, esprimendo la capacità chelante come descritto in precedenza.
Saggio di antagonismo in liquido
I filtrati batterici ottenuti, come descritto nei paragrafi precedenti, sono stati utilizzati come base acquosa per la costituzione del substrato MMU (pH 7.0) per la crescita di Fol. Il saggio di antagonismo in mezzo liquido è stato eseguito in piastre multiwell da 96 pozzetti. In ogni pozzetto sono stati aggiunti 195 µl di substrato e 5µl di una sospensione conidica avente concentrazione 2x105 conidi ml-1 (circa 1000 conidi per pozzetto). L’attività inibente dei filtrati colturali è stata valutata oltre che nei confronti di Fol ceppo wild type anche nei confronti dei mutanti nei geni delle MAPK (Δfmk1, Δhog, Δmpk1). Le piastre sono state poste ad incubare a 28°C con un’agitazione di 200 rpm e la crescita è stata monitorata misurando OD600 ad intervalli di tempo costanti (24, 48, 72 e 96 ore). Per i brodi di coltura dei mutanti batterici CHA1196 e CHA1242 è stata valutata la capacità di inibizione in seguito al
59 trattamento con concentrazioni crescenti di FeCl3 (2 mM e 5 mM) e la crescita fungina è stata monitorata come indicato precedentemente. Allo scopo esprimere l’attività chelante del filtrato colturale dei batteri in equivalenti di un agente chelante chimico sono state eseguite delle soluzioni a diverse concertazioni di EDTA (2 – 1 - 0,5 - 0,3 - 0,2 - 0,16 - 0,14 - 0,1 - 0,075 - 0,05 - 0,01 - 0,005 - 0,0025 - 0,00125 - 5x10-4 - 5x10-5 - 5x10-6 - 5x10-7 - 5x10-8 - 5x10- 9
- 5x10-10 - 0 mM). L’analisi CAS di queste diluizioni ha permesso di stimare la concentrazione di EDTA avente capacità chelante prossima a quella dei filtrati colturali batterici. Definita la concentrazione di EDTA con capacità chelante paragonabile a quella dei filtrati colturali dei mutanti batterici CHA1196 e CHA1242 è stato valutato l’accrescimento in liquido di Fol ceppo wild type in presenza di EDTA. Per tale saggio è stato utilizzato il substrato MMU con aggiunta di EDTA alle concentrazioni 2mM - 1 mM - 0,5 mM - 0,2 mM a pH 7, utilizzando come controllo l’accrescimento fungino in MMU. La crescita fungina è stata valutata come descritto in precedenza.
Estrazione dei metaboliti dal brodo colturale del ceppo CHA1242
Il filtrato colturale del ceppo mutante di P. fluorescens CHA1242 (circa 50 ml) è stato acidificato a pH 2.0 con l’aggiunta di qualche goccia di HCl (37% v/v), trasferito in un imbuto separatore e sottoposto ad estrazione liquido/liquido aggiungendo 50 ml di etilacetato e agitando vigorosamente per 5 minuti. Dopo la separazione delle due fasi (dopo circa 30 minuti), la fase organica (superiore) è stata trasferita in un pallone da vuoto (figura 9), mentre la fase acquosa (inferiore) è stata sottoposta ad estrazione per ulteriori due volte. Le tre frazioni organiche sono state riunite e portate a secco mediante evaporatore rotativo (Strike 300, steroglass), con bagnomaria a 45°C e pressione ridotta. Il residuo è stato risospeso in 50 ml di MMU. La fase acquosa è stata trattata per 10 minuti in evaporatore rotativo allo scopo di eliminare i residui di etilacetato ed è stata utilizzata come base acquosa per la costituzione del substrato MMU. Il brodo di coltura del ceppo CHA1242 è stato sottoposto anche ad estrazione con fenolo trattando 50 ml di brodo con 5 ml di solvente. Le due componenti sono state emulsionate agitando vigorosamente per 30 min. La frazione fenolica, separata dalla fase acquosa per centrifugazione a 4.000 rpm per 10 min, è stata portata a secco in evaporatore rotativo con bagnomaria a 45°C e pressione ridotta e risospesa in 50 ml di MMU. Anche in questo caso la frazione acquosa privata del fenolo residuo è stata utilizzata come base per la costituzione del substrato MMU. Degli estratti in etilacetato e fenolo, cosi come delle fasi acquose esauste, è stata analizzata la OD400 e ne è stata valutata la capacità chelante mediante
60 saggio CAS come descritto in precedenza, inoltre è stata valutata anche la capacità inibente nei confronti di Fol come descritto nei paragrafi precedenti.
Valutazione delle alterazioni nella rizosfera prodotte dalla proliferazione batterica
In seguito alle valutazioni fenotipiche in vitro dei ceppi wild type e mutanti di P. fluorescens si è provveduto ad analizzare le alterazioni che la proliferazione dei ceppi batterici determinava in un contesto simile alla rizosfera. La sperimentazione è stata condotta utilizzando piante di pomodoro della varietà Moneymaker procedendo come descritto nel paragrafo riguardante la produzione degli essudati radicali. Degli essudati radicali prodotti in presenza dei ceppi wild type e mutanti di P. fluorescens è stato valutato il pH, la capacità chelante ed il chemiotropismo fungino comparando i risultati con quelli ottenuti dagli essudati radicali prodotti in assenza di batteri. Le alterazioni prodotte dalla proliferazione batterica sulla superficie radicale sono state misurate anche in termini di germinabilità conidica. Il saggio è stato condotto in piastre multiwell, ponendo in ciascun pozzetto 200 µl di essudato radicale con circa 1000 conidi di Fol. La piastre multiwell così allestite sono state incubate per 15 ore a 28°C a 200 rpm di agitazione. Al termine del periodo di incubazione è stata valutata la percentuale di conidi germinati mediante osservazione al microscopio ottico a 100 ingrandimenti contando almeno 200 conidi per ogni pozzetto. La germinazione conidica ottenuta negli essudati radicali è stata comparata con la germinazione conidica in PDB.