TPEN
mitochondrial
damage
[ Zn
2+]
icyclin-Cdk
inhibitor/cyclin
genes
pro-apoptotic
/anti-apoptotic
genes
caspase activation
APOPTOSIS
CELL CYCLE ARREST
(G1-phase)
TPEN
mitochondrial
damage
[ Zn
2+]
icyclin-Cdk
inhibitor/cyclin
genes
pro-apoptotic
/anti-apoptotic
genes
caspase activation
APOPTOSIS
Figura 38. Modello dei meccanismi di azione del TPEN su linee cellulari di adenocarcinoma pancreatico
Due sono gli effetti più interessanti del TPEN: 1) è molto più efficace nell’inibire la vitalità di linee cellulari tumorali pancreatiche rispetto ad altri sette composti anti-tumorali; 2) la sua attività citotossica è molto minore nei fibroblasti rispetto a cellule tumorali.
I chemioterapici in uso per il cancro del pancreas sono il 5-fluorouracile e la gemcitabina. Quest’ultima è considerata migliore sebbene presenti un tasso di risposta inferiore al 20% [73, 74]. Sarebbe quindi importante trovare dei nuovi composti che risultino più efficaci della gemcitabina nella cura del cancro del pancreas. In quest’ottica, i dati mostrati in questo lavoro diventano degni di attenzione. Esperimenti di proliferazione cellulare dose-dipendente e tempo-dipendente dimostrano che il TPEN è molto più efficace nell’inibire la crescita di cellule tumorali pancreatiche della gemcitabina (un nucleoside analogo della citidina) e del 5-
fluoruracile (una base analoga all’uracile) e di altri cinque composti anti-tumorali come l’irinotecan (un inibitore della DNA topoisomerasi I), il cisplatino (un intercalante del DNA), l’edelfosina (un alchilo-lisofosfolipide), la tricostatina A (un inibitore delle deacetilasi istoniche) e la mitomicina C (un inibitore della sintesi del DNA). Inoltre i risultati mostrano che, l’aggiunta di zinco al mezzo di coltura previene l’inibizione cellulare data dal TPEN, confermando che l’effetto citotossico dipende dalla sua attività chelante e non da effetti aspecifici.
Lo studio dei meccanismi molecolari coinvolti nell’arresto del ciclo in fase G1 ha mostrato che il TPEN è in grado di aumentare il rapporto tra i livelli di espressione dei geni inibitori dei complessi ciclina-cdk (P57 e P19) e i geni delle cicline (CICLINA A e CICLINA B1). E’ stato dimostrato in precedenza che l’induzione di p19 e p57 arresta la progressione del ciclo cellulare in fase G1 [75], mentre l’inibizione delle cicline A e B1 blocca il ciclo cellulare in fase S e G2/M e in fase G2/M, rispettivamente [76, 77]. Il TPEN modula l’espressione di geni del ciclo cellulare in modo da arrestare potenzialmente tutte le fasi del ciclo, quindi, oltre al blocco rilevato in fase G1, probabilmente dovuto al contributo prevalente dell’induzione di p19 e p57, si può ipotizzare che ci sia un rallentamento globale nella progressione del ciclo cellulare, non apprezzabile sperimentalmente dal calcolo dei valori percentuali. Inoltre, poiché il TPEN non è in grado di regolare altri geni coinvolti nel ciclo cellulare, come P21 e P27, si può supporre che la riduzione di zinco agisca specificamente sull’attività di determinati attivatori o repressori trascrizionali di geni che controllano il ciclo cellulare. Una regolazione specifica dei geni del ciclo cellulare diventa importante soprattutto se si considera che il cancro del pancreas presenta una elevata frequenza di mutazione in P16 e P15 [78].
L’analisi apoptotica mostra che il TPEN è capace di indurre anche una forte morte cellulare apoptica nelle cellule pancreatiche tumorali, che è completamente annullata dall’aggiunta di
ioni zinco. Le caratteristiche apoptotiche sono state confermate dalla presenza di nucleosomi nella frazione citoplasmatica di cellule tumorali trattate con TPEN (dati non mostrati). La riduzione di zinco intracellulare è in grado di incrementare il rapporto tra i livelli di espressione dei geni mitocondriali apoptotici e quelli anti-apoptotici, appartenenti alla famiglia di Bcl-2, di aumentare la percentuale delle cellule con un basso potenziale di membrana e di attivare le caspasi 3 e 8. Poiché i membri pro- e anti-apoptotici della famiglia di Bcl-2 sono noti per la loro funzione di regolare il macchinario apoptotico e i loro livelli di espressione relativi sono critici per il destino della cellula, l’incremento del rapporto dell’espressione dei geni apoptotici rispetto agli antiapoptotici può essere cruciale nell’induzione del processo apoptotico determinato da TPEN. Inoltre, poiché è stato dimostrato che lo zinco inibisce l’attivazione della caspasi 3 [33] la sua deplezione può favorire il processamento proteolitico della caspasi 3, inducendo apoptosi nelle cellule tumorali pancreatiche. Per quanto riguarda la caspasi 8, i dati presenti nella letteratura suggeriscono che la sua attivazione potrebbe non dipendere da un contributo diretto della diminuzione di zinco intracellulare, ma da una mera conseguenza dell’attivazione della caspasi 3 [79].
E’ stato precedentemente dimostrato che il TPEN determina l’inibizione della crescita cellulare tramite l’induzione di stress ossidativo e di P53 [80, 81]. Per valutare se anche in questo caso, oltre a quello di un aumento dello zinco intracellulare dato dal PDTC, p53 avesse un ruolo nella parziale resistenza dei fibroblasti al TPEN, i fibroblasti sono stati trattati con il chelante per valutare i livelli di p53 e p53 fosforilato. Inoltre, è stata valutata la vitalità dei fibroblasti trattati con TPEN in assenza o presenza di NAC. L’esperimento di Western blot e la curva di crescita (non inseriti in questa tesi) hanno mostrato che il TPEN non è in grado né di regolare p53 né di indurre ROS, come rivela l’incapacità del NAC di annullare l’effetto antiproliferativo del TPEN. Quindi, la minor sensibilità al TPEN dei fibroblasti rispetto alle cellule tumorali, non è data dalla regolazione di p53, ma
probabilmente dalla differente riduzione del livello di zinco intracellulare dopo l’uso del chelante (circa 8 volte in meno nei fibroblasti).
In conclusione, in questa tesi è stato mostrato che agendo sull’omeostasi dello zinco, sia aumentando che diminuendo la sua concentrazione cellulare, è possibile inibire fortemente la crescita di cellule tumorali pancreatiche attraverso l’arresto nella progressione del ciclo cellulare e/o l’apoptosi, preservando almeno parzialmente la vitalità dei fibroblasti normali. L’insieme dei dati presentati può fornire la base per uno studio indirizzato allo sviluppo di una terapia contro il cancro del pancreas basata sull’omeostasi intracellulare dello zinco.
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