Le cellule dendritiche DCs rappresentano l’elemento di congiunzione cellulare tra la risposta immunitaria innata e quella adattativa in quanto sono responsabili dell’attivazione dei linfociti T (Banchereau et al., 1998). Durante gli stress metabolici, in assenza di stimoli, l’Ado si comporta da chemiotassina mediante l’attivazione dei recettori A1 e A3 favorendo la chemiotassi delle cellule dendritiche immature verso il sito dell’insulto (Panther et al., 2001; Fossetta et al., 2003). E’ noto che le cellule dendritiche plasmacitoidi (pDCs) sono potenti modulatori della risposta immunitaria e producono elevati livelli di interferoni di tipo 1 durante le infezioni virali, sebbene la loro presenza sia stata osservata anche a livello di siti interessati da danno tissutale in diverse condizioni infiammatorie come allergie, patologie autoimmuni e cancro. Le pDCs immature esprimono elevati livelli di recettore A1 e bassi livelli di recettore A2A (Schnurr et al., 2004). L’attivazione del recettore A1 nelle pDCs immature ne stimola la migrazione verso il sito d’insulto. Tuttavia, una volta raggiunto lo stato di maturazione, le pDCs esprimono elevati livelli di recettore A2A la cui attivazione sopprime la produzione di molecole pro-infiammatorie come IL-6, IL- 12 e IFN-α (Schnurr et al., 2004). In cellule dendritiche completamente mature, l’Ado sopprime il rilascio di IL-12 indotto dall’attivazione dei recettori Toll-like Receptors (TLRs), attraverso l’aumento di cAMP intracellulare indotto dalla stimolazione del recettore A2A, aumentando per contro, la produzione di IL-10. Inoltre l’attivazione del recettore A2A riduce la capacità delle cellule dendritiche di attivare le cellule T CD45RA+ (Panther et al., 2003). Diversi autori hanno osservato che cellule DCs pre-condizionate con Ado favoriscono la crescita tumorale, una volta iniettate nel sito della neoplasia (Novitskiy et al., 2008). Tale effetto era direttamente correlato ad una riduzione del rilascio di citochine TH1 e ad un aumento di citochine di tipo TH2 come IL-10, TGF-β e IDO (Novitskiy et al., 2008). In conclusione, l’influenza dell’Ado sui processi di differenziazione cellulare e sul diverso comportamento delle DCs potrebbe rappresentare un importante meccanismo di tolleranza immunitaria con il quale le cellule tumorali riescono ad evadere la sorveglianza della componente immunitaria dell’ospite.
4.1.6e Macrofagi
Un’altro importante anello di congiunzione tra la componente immunitaria innata e quella adattativa è rappresentato dai MØ, i quali attraverso la produzione di molecole infiammatorie e la presentazione dell’antigene alle cellule effettrici, rappresentano una prima linea di difesa nei confronti delle cellule tumorali. Mediante l’utilizzo di animali KO per i recettori dell’Ado, recenti studi hanno permesso di delineare dettagliatamente, gli effetti dell’Ado sulla funzione delle diverse componenti cellulari della risposta immunitaria. Ad esempio, diversi studi sono in accordo col considerare il recettore A2A il principale responsabile degli effetti inibitori dell’Ado sulla produzione di TNF-α (Hasko et al., 2000; Ryzhov et al., 2008). Inoltre la possibilità che qualche altro recettore potesse essere coinvolto negli effetti inibitori dell’Ado, nasce dal fatto che sia il NECA che l’IB-MECA (CF- 101) sono in grado di inibire la produzione di TNF-α in topi A2A KO (Hasko et al., 2000; Kreckler et al., 2006). Un’approccio sperimentale caratterizzato dall’utilizzo di animali A2A KO in combinazione con agonisti selettivi del recettore A2B dimostra che anche questo recettore svolge un’azione inibitoria sul rilascio di TNF-α nei MØ (Kreckler et al., 2006). Tuttavia sembra che gli effetti del recettore A2B siano di minore rilevanza rispetto a quelli del recettore A2A, in quanto una delezione genetica del primo non altera gli effetti inibitori indotti dall’attività del secondo (Kreckler et al., 2006; Ryzhov et al., 2008). In maniera analoga a quanto accade per la produzione di TNF- α, il recettore A2A incrementa il rilascio di IL-10 da parte dei MØ. Tali risultati emergono da recenti esperimenti in cui l’Ado si è dimostrata incapace di incrementare il rilascio di IL-10 indotta da Escherichia coli in MØ deficienti del recettore A2A (Csokaet al., 2007). Se è vero che il recettore A2B non ha quasi alcuna influenza sulla produzione di TNF-α e IL-10 nei MØ, tuttavia ha un ruolo chiave sul rilascio di IL-6 (Ryzhov et al., 2008). Infatti Ryzov e coll. hanno osservato che la somministrazione di NECA in MØ A2B KO non induce il rilascio di IL-6 rispetto al controllo (Ryzhov et al., 2008). E’ opportuno considerare che tali dati vanno, in ogni caso, interpretati con molta cautela, in quanto derivano da approcci di tipo farmacologico anche in ragione del fatto che molti dei ligandi utilizzati al fine degli studi sopra citati non sono particolarmente selettivi.
4.2 Scopo
Nonostante numerosi studi siano stati effettuati al fine di delineare un profilo funzionale dei diversi sottotipi recettoriali dell’Ado, nella risposta immunitaria, soprattutto in condizioni patologiche, scarse e poco precise risultano le informazioni relative al ruolo svolto dal recettore A3 sul sistema immunitario. Al contrario invece, numerosi studi al riguardo concordano col considerare il recettore A2A il principale responsabile degli effetti immunosoppressivi dell’Ado. Come già detto in precedenza, sulla base dello stato dell’arte attuale, il recettore A3 è un recettore metabotropico accoppiato principalmente a proteina Gi che diversamente dal recettore A2A che invece è accoppiato a proteina Gs, riduce drasticamente i livelli di cAMP intracellulare. Inoltre mediante l’attivazione di una proteina Gq il recettore A3 è capace di attivare, attraverso una rete di segnali dipendenti dai livelli di Ca2+ intracellulare, diverse signaling pathways ad attività mitogena, come ERK, JNK, P38, Akt. Uno studio in vivo effettuato in parallelo al presente progetto di ricerca ha dimostrato che il Cl-IB-MECA è capace di ridurre la crescita tumorale in un modello murino di melanoma (Fig.1). Inoltre, in associazione all’inibizione della crescita tumorale è stato osservato un significativo incremento del numero di linfociti T CD8+, DCs e MØ, a livello della lesione neoplastica (Fig.2). Alla luce di ciò e sulla base dello stato dell’ arte, lo scopo di questa terza sezione del progetto di dottorato è stato quello di studiare gli effetti diretti del Cl-IB-MECA, sulle popolazioni cellulari immunitarie sopracitate attraverso indagini più approfondite sul comportamento e sull’ espressione fenotipica conseguenti al trattamento con il Cl-IB-MECA. Infine ulteriori studi molecolari sono stati effettuati sulla linea mieloide monocitaria-macrofagica, al fine di caratterizzare la farmaco dinamica alla base degli effetti osservati in seguito al trattamento con Cl-IB-MECA.
4.3 Risultati
4.3.1 Attività anti-tumorale del Cl-IB-MECA in un modello murino di