3.6 Applicazioni mediche dell’analisi dell’espirato umano
3.6.2 Cirrosi epatica
In prossimità della conclusione del lavoro di tesi, c’è stata anche la possibilità di analizzare l’espirato di alcuni pazienti sottoposti a trapianto di fegato.
L’obiettivo di queste misure preliminari riguardava la possibilità di diagnosticare eventuali crisi di rigetto d’organo e monitorare la ripresa della funzionalità epatica. A questo scopo è stata effettuata l’analisi di campioni di espirato di pazienti in regime di ricovero pre- e post-trapianto di fegato.
Il campionamento e l’analisi dell’espirato di sette pazienti (6 maschi e 1 femmina di età compresa tra 19 e 63 anni), affetti da cirrosi epatica, è
stato condotto nelle stesse modalità e condizioni sperimentali descritte nelle tabelle 2.1 e 2.2.
Dai risultati ottenuti, è stata riscontrata la presenza del segnale relativo al gas anestetizzante (sevoflurano) e ad un suo metabolita (esafluoroisopropanolo) in tutti i cromatogrammi relativi ai campioni di espirato dei pazienti sottoposti a trapianto di fegato.
Nei grafici 3.24 e 3.25 è riportato l’andamento dei valori dell’area di tali segnali nel tempo. Come si può osservare, questi dati, anche se relativi ad un numero molto limitato di casi, confermano la capacità del metodo sviluppato di seguire una cinetica di smaltimento, nel caso in esame del gas anestetizzante e del suo metabolita principale.
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 0.0 2.0x107 4.0x107 6.0x107 8.0x107 1.0x108 1.2x108 1.4x108 1.6x108 1.8x108 A rea s e vo flurano (u .a .) Giorni Post-Trapianto
Paz.1 Paz.2 Paz.3 Paz.4 Paz.5 Paz.6 Paz.7
Figura 3.24 Area del segnale relativo al gas anestetizzante, a diversi tempi
(giorni post-trapianto) di prelievo del campione di espirato dei pazienti sottoposti a trapianto di fegato.
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 0.0 5.0x106 1.0x107 1.5x107 2.0x107 2.5x107 Giorni Post-Trapianto A rea esa flu oro iso pro pan olo (u .a .)
Paz.1 Paz.2 Paz.3 Paz.4 Paz.5 Paz.6 Paz.7
Figura 3.25 Area del segnale relativo ad un metabolita del gas anestetizzante, a
diversi tempi (giorni post-trapianto) di prelievo del campione di espirato dei pazienti sottoposti a trapianto di fegato.
O F F F F F F F F F F F F F OH H
Poiché il metabolismo epatico è la via principale di eliminazione di moltissimi farmaci e le malattie epatiche più gravi sono in grado di alterare in maniera rilevante tale metabolismo, sembra possibile ottenere indicazioni sulla ripresa della funzionalità epatica proprio mediante la valutazione della cinetica di smaltimento del gas anestetizzante, eseguendo, nei giorni successivi al trapianto, l’analisi dell’espirato. Ovviamente il metodo deve ancora essere standardizzato mediante lo studio della cinetica di smaltimento da parte di un fegato sano per poter ottenere dati di riferimento.
Questa possibile applicazione risulta particolarmente importante se si considera che nel periodo post-trapianto, il chirurgo ha solo una via per verificare la funzionalità del fegato: la biopsia, tecnica molto invasiva e non sempre praticabile, se confrontata con l’analisi dell’espirato.
Conclusioni
La composizione chimica dell’espirato umano riflette le condizioni metaboliche generali e può fornire utili e preziose informazioni sullo stato di salute della persona e sull’eventuale esposizione a sostanze inquinanti, grazie al rapido equilibrio di diffusione attraverso la membrana alveolare fra le sostanze volatili disciolte nel sangue e l’aria presente negli alveoli dei polmoni. L’analisi dell’espirato rappresenta perciò un’interessante procedura di monitoraggio non invasivo per prevedere l’insorgere di malattie e disfunzioni del corpo umano e seguirne l’evoluzione durante il trattamento medico.
Le principali difficoltà che sinora hanno impedito l’applicazione di una metodologia standardizzata dell’analisi dell’espirato sono legate, oltre al campionamento e a problematiche connesse con l’analisi strumentale, alla variabilità nella composizione dell’espirato stesso.
Il lavoro di tesi svolto ha riguardato l’ottimizzazione di metodologie analitiche per il campionamento e la determinazione quantitativa di vari composti chimici presenti nell’espirato umano.
La procedura impiegata per le analisi è costituita dalle seguenti fasi: raccolta dei campioni di espirato in sacche di opportuno materiale, preconcentrazione dei vari composti in tubi di adsorbimento mediante estrazione in fase solida (SPE), separazione degli analiti mediante gascromatografia e rivelazione tramite spettrometria di massa.
Il sistema di campionamento è stato ottimizzato confrontando sacche di differenti materiali quali il Nalophan, il Tedlar ed il Cali-5-bond. La comparazione tra i suddetti materiali è stata effettuata mediante prove di rilascio di composti chimici da parte del materiale delle sacche e di stabilità chimica dei vari composti d’interesse, utilizzando miscele standard gassose a concentrazione nota. Il Nalophan, per la bassa contaminazione di fondo ed i costi ridotti che ne consentono il monouso, è risultato il materiale più idoneo per la realizzazione delle sacche di campionamento.
A causa della bassa concentrazione della maggior parte delle sostanze presenti nell’espirato, dopo il campionamento e prima dell’analisi, è necessario uno stadio di preconcentrazione del campione. Quest’ultima è stata realizzata mediante l’impiego della tecnica SPE che prevede l’adsorbimento di un prefissato volume di campione su un’opportuna fase stazionaria. Dopo un primo desorbimento termico degli analiti dal tubo di adsorbimento, si ha una loro focalizzazione in una criotrappola ed infine un ulteriore desorbimento che trasferisce gli analiti dalla trappola alla colonna cromatografica.
La scelta della fase stazionaria è stata effettuata valutando le prestazioni dei tubi di adsorbimento impaccati con diversi tipi di fasi stazionarie quali il TenaxGR ed il CarbopackY-CarbopackB-Carboxen1003. In considerazione dell’elevato contenuto di vapore acqueo presente nell’espirato, e dell’effetto negativo della presenza dell’acqua sull’efficienza del processo di ritenzione degli analiti nel tubo di adsorbimento, sono state effettuate prove introducendo nel sistema di preconcentrazione una cartuccia contenente un agente disidratante. In particolare, è stata verificata l’efficacia del solfato di sodio anidro, del perclorato di magnesio e del solfato di calcio anidro. Il TenaxGR, caratterizzato da una bassa affinità per l’acqua, ed il solfato di sodio sono risultati rispettivamente la fase stazionaria e l’agente disidratante più idonei.
La procedura analitica sviluppata è stata, infine, applicata all’analisi di campioni di espirato prelevati da soggetti affetti da alcune patologie, diabete e cirrosi epatica, e da soggetti sottoposti al test di tolleranza al glucosio.
Nel caso del diabete, i risultati ottenuti, per quanto preliminari, hanno confermato la correlazione tra contenuto di acetone nell’espirato e diabete, ed hanno permesso di evidenziare per la prima volta che anche l’isopropanolo può essere utilizzato come marker di questa patologia. Queste misure hanno anche permesso di mettere in evidenza la necessità di conoscere in modo approfondito la relazione tra la presenza di un
determinato composto chimico nell’espirato, correlato a specifici processi metabolici, e l’alterazione della sua concentrazione a causa dell’esposizione diretta al composto considerato o ad altre sostanze chimiche esogene che ne possono alterare il contenuto, attraverso i processi metabolici del nostro organismo.
Nel caso della cirrosi epatica, i primi e parziali risultati ottenuti, hanno permesso di evidenziare la possibilità di ottenere utili indicazioni sulla ripresa della funzionalità epatica nei giorni successivi al trapianto mediante la valutazione della cinetica di smaltimento del gas anestetizzante presente dell’espirato. Questa possibile applicazione dell’analisi dell’espirato risulta particolarmente importante se si considera che nei giorni immediatamente successivi al trapianto, il chirurgo ha solo una via per verificare la funzionalità del fegato: la biopsia, tecnica molto invasiva e non sempre praticabile, se confrontata con l’analisi dell’espirato.
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Ringraziamenti
Un sentito ringraziamento al mio relatore Prof. Roger Fuoco, il quale mi ha seguito in questo anno di tesi con grande professionalità offrendomi utili consigli e suggerimenti grazie ai quali ho potuto portare a termine il mio percorso di studi con serenità.
Un grazie grandissimo anche al Prof. Ceccarini, alle Dott.se Trivella e Lenzi, a Fabio Di Francesco e poi ancora agli straordinari Massimo Onor e Sara Tabucchi per come hanno saputo comprendermi ed aiutarmi giorno per giorno trasmettendomi una gran voglia di fare. In un clima di grande armonia, di generosa collaborazione e di contagiosa allegria sono riusciti a farmi sentire a mio agio e molto serena, per cui posso affermare che per realizzare questa mia tesi la loro presenza e la loro guida sono state davvero preziose e determinanti.
Molte sono ancora le persone che ho conosciuto nel contesto in cui in quest’anno ho lavorato per la tesi: Emanuela Pitzalis, Marco Mascherpa, Roberto Spinello, Alessandro D’Ulivo, Emilia Bramanti, Manuela Cempini, Giacomo Pacchi, Karin Jacovozzi, Daniele Costanzo e Pietro Salvo. A tutti loro rivolgo un sincero ringraziamento per ogni forma di aiuto che mi hanno generosamente offerto, per la cordialità e l’affetto dimostratomi e per le ore felici trascorse insieme.
Infine un immancabile grazie con tutto il cuore alla mia mamma, a Laura mia sorella e Lucanos il suo ragazzo, che non mi hanno mai fatto mancare il loro sostegno ed il loro incoraggiamento e mi sono stati sempre vicini come meglio non avrebbero potuto fare.