Citometria a flusso

La citometria a flusso (CF) è una tecnica di misura delle proprietà delle cellule che, negli ultimi anni, ha raggiunto una notevole diffusione, sia nei laboratori clinici che in quelli di ricerca.

Differenti fattori hanno contribuito a questo notevole sviluppo e sono rappresentati da: - possibilità di utilizzare più laser di emissione, in modo da effettuare analisi

multiparametriche a quattro e più colori;

- disponibilità di anticorpi monoclonali con un’ampia gamma di fluorocromi e diretti contro un’ampia varietà di antigeni di membrana e/o intracellulari;

- riduzione dei tempi di esecuzione delle analisi e della complessità nell’utilizzo dello strumento.

Ad oggi esistono numerosi i campi di applicazione della CF, tra cui: - lo studio della ploidia e della proliferazione cellulare;

- l’analisi del ciclo cellulare;

- l’analisi immunofenotipica multiparametrica;

- la risposta del sistema immunitario alla somministrazione di vaccini (cellule antigene-specifiche, produzione di citochine, ecc);

- i livelli di apoptosi in differenti patologie.

Le origini della CF sono strettamente connesse con la microscopia ottica. In effetti, un citometro a flusso non è altro che un microscopio dotato di un sistema automatico di trasporto delle cellule e di un dispositivo di misura della luce che sostituisce l’occhio dell’osservatore. Quest’ultimo aspetto, peraltro, qualifica in modo specifico la caratteristica principale della CF, cioè il fatto che si tratta di una tecnica di misura e non una tecnica di sola osservazione. Da qui emerge anche il principale limite della CF, ossia la sua incapacità di descrivere i dettagli della forma e della struttura della cellula, salvo casi particolari in cui valutazioni di questo tipo possono essere ottenute in via indiretta per specifiche caratteristiche fisiche della cellula o con l’uso di tecniche di colorazione capaci di discriminare specifici compartimenti cellulari.

Le tecniche di colorazione, o di reazione con sostanze fluorescenti, rappresentano per la CF l’analogo delle tecniche, prevalentemente in assorbimento, caratteristiche della microscopia ottica.

Maria Luigia Biggio

“Danno ossidativo ed aggregati proteici nella Sclerosi Laterale Amiotrofica. Possibili target diagnostici e terapeutici”.

Tesi di Dottorato in Scienze Biomediche, curriculum Fisiopatologia Medica. Università degli studi di Sassari Pag. 86

Le tecniche in fluorescenza garantiscono elevata sensibilità di misura, per cui è possibile valutare in maniera quantitativa la presenza di sostanze fino a poche centinaia di molecole per cellula. Il maggior inconveniente delle misure in fluorescenza, ovvero l’attenuazione del segnale in seguito ad eccitazione (fotobleaching), è del tutto trascurabile in CF, dal momento che i tempi di eccitazione sono limitati a durate dell’ordine di millisecondi, laddove i tempi di fotobleaching possono essere di secondi, minuti e maggiori (169).

I principali vantaggi offerti dalla CF sono la possibilità di analisi multiparametriche, l’elevato numero di cellule esaminate, la rapidità dei tempi di analisi (oltre 1000 cellule/sec), l’obiettività, la riproducibilità e l’affidabilità statistica delle letture, e la capacità di processare i campioni, conservandone la vitalità cellulare.

Accanto a tutti questi aspetti vantaggiosi della CF, esistono anche alcune importanti limitazioni della metodica, rappresentati dall’incapacità di analisi di cellule molto rare che, a causa del loro ridotto numero in confronto agli eventi analizzati, potrebbero essere difficilmente separabili dal “rumore di fondo”, dalla necessità di dover lavorare con campioni in fase monodispersa, dall’impossibilità di localizzare la sede di provenienza del segnale in caso di contemporanea presenza di marcatori nei diversi compartimenti cellulari e dai costi eccessivi dei vari marcatori.

La CF consiste in una metodica qualitativa e quantitativa che consente una rapida analisi di un elevato numero di cellule in breve tempo (50.000 cellule in pochi secondi), quantificando numerosi parametri per ogni singola cellula. Misura, inoltre, le caratteristiche ottiche e fluorescenti di singole cellule o di altre particelle, inclusi nuclei, microrganismi, preparazioni di cromosomi e biglie in lattice e permette anche di determinare il contenuto di DNA e RNA, identificare i diversi sottotipi cellulari, gli organelli intracellulari e l’attività di alcuni enzimi.

I marcatori fluorescenti possono legare o intercalare con differenti componenti cellulari ed è possibile utilizzare anticorpi coniugati a coloranti fluorescenti in grado di legare specifiche proteine sulle membrane cellulari e all’interno delle cellule. Quando le cellule marcate passano attraverso una sorgente luminosa, le molecole fluorescenti sono eccitate ad uno stato energetico maggiore. Ritornando poi al loro stato energetico iniziale, i fluorocromi emettono un’energia con una lunghezza d’onda maggiore.

Maria Luigia Biggio

“Danno ossidativo ed aggregati proteici nella Sclerosi Laterale Amiotrofica. Possibili target diagnostici e terapeutici”.

Tesi di Dottorato in Scienze Biomediche, curriculum Fisiopatologia Medica. Università degli studi di Sassari Pag. 87

Il principio di base della citometria a flusso (Fig. 25) prevede che una sospensione cellulare monodispersa (es. cellule del sangue periferico, aspirato midollare, ecc) venga iniettata in un sistema fluidico il quale, in opportune condizioni idrodinamiche, tende a trasportare le cellule in maniera separata ed ordinata fino al punto di misura, dove incontra il fascio di luce focalizzata proveniente dal laser. L’incontro tra il raggio di luce ed ogni singola cellula presente nel flusso cellulare genera dei segnali. Questi sono legati alle caratteristiche fisiche della cellula e alla presenza di molecole fluorescenti. I segnali sono raccolti da un sistema di lenti, specchi e filtri ottici ed inviati ai rispettivi sensori (fotodiodi e fotomoltiplicatori) che ne misurano l’intensità. I segnali elettrici provenienti da ogni sensore, opportunamente amplificati e digitalizzati, sono inviati ad un analizzatore di dati, che provvede alla loro visualizzazione su monitor, rappresentazione grafica e definizione statistica.

Fig. 25 Principio di funzionamento di un citometro a flusso nelle differenti fasi

Il principio di funzionamento di un citometro a flusso prevede differenti fasi, qui sotto elencate:

1) le cellule di una popolazione eterogenea sono aspirate dalla provetta ed immesse in una camera di flusso, dove sono separate le une dalla altre;

2) ogni singola cellula viene poi attraversata da un fascio di luce, che eccita i fluorocromi e determina l’emissione di un segnale fluorescente;

Maria Luigia Biggio

“Danno ossidativo ed aggregati proteici nella Sclerosi Laterale Amiotrofica. Possibili target diagnostici e terapeutici”.

Tesi di Dottorato in Scienze Biomediche, curriculum Fisiopatologia Medica. Università degli studi di Sassari Pag. 88

3) il segnale, passando attraverso un sistema di filtri e specchi, raggiunge un rivelatore; 4) il segnale viene processato elettronicamente, trasformato da analogico a digitale ed inviato all’analizzatore, che elabora il dato e lo visualizza tramite un grafico;

5) attraverso piastre di deflessione le cellule analizzate possono essere raccolte separatamente tramite un processo definito “sorting”.

Maria Luigia Biggio

“Danno ossidativo ed aggregati proteici nella Sclerosi Laterale Amiotrofica. Possibili target diagnostici e terapeutici”.

Tesi di Dottorato in Scienze Biomediche, curriculum Fisiopatologia Medica. Università degli studi di Sassari Pag. 89

CAPITOLO 4: Metodi