LIG15 SAFORA® PURPLE DANZIGER
LIG19 SAFORA® BLUE DANZIGER
LIS30 SAFORA® DARK BLUE DANZIGER
LSB40 ‘BARBIE WINGS’® HILVERDA
LSB41 ‘CHERRY WINGS’® HILVERDA
LSB43 ‘LEMON WINGS’® HILVERDA
Tabella 6 - Elenco dei genotipi di Limonium (6 cloni selezionati dal CRA-VIV e 6 varietà commerciali) utilizzate nelle prove agronomiche e per la caratterizzazione molecolare con marcatori AFLP.
3.3.6. Messa a punto dei protocolli di moltiplicazione e radicazione in vitro
Le prove sono state effettuate sui 6 cloni selezionati descritti nel paragrafo 3.3.5 (Fig. 9). Per ciascuno di essi sono stati saggiati i 3 substrati di moltiplicazione e di radicazione che hanno fornito i migliori risultati nelle prove preliminari.
Disegno sperimentale per le prove di moltiplicazione in vitro.
1a. Valutazione degli effetti ormonali:
Sono stati inseriti 6 germogli singoli per vaso, alla seconda subcoltura per ciascuno dei substrati a base MS saggiati, con 9 ripetizioni (vasi) per prova.
Per ciascuna prova sono stati valutati i seguenti parametri:
a) tasso di moltiplicazione totale (numero medio di germogli ottenuti da un singolo germoglio iniziale);
b) tasso di moltiplicazione al netto di eventuali germogli necrotici o vitrescenti;
c) tasso di produzione di germogli ben conformati di lunghezza > 1.5 cm, già idonei per il passaggio alla fase di radicazione, senza bisogno di fasi di allungamento intermedie (Fig. 10);
d) incremento giornaliero medio di biomassa (peso fresco);
e) valutazione complessiva della qualità del germoglio, in particolare: - sviluppo e consistenza dell’apparato fogliare;
- presenza/assenza di callo, vitrescenza, fenomeni di imbrunimento e necrosi.
Al fine di massimizzare gli effetti delle combinazioni ormonali allo studio, si è ritenuto opportuno mantenere il più a lungo possibile i germogli nei vari mezzi sperimentali. La durata delle subcolture, pertanto, è stata mantenuta tra le 4-5 settimane per i cloni appartenenti al gruppo L. bonduellei x sinuatum (LSB40, LSB41, LSB43), a più rapida proliferazione, e tra 8-9 settimane per gli altri cloni (LIG15, LIG19, LIS30).
Figura 10 – Suddivisione in classi dei germogli ottenuti dalle prove di moltiplicazione in vitro: A) germogli grandi, ben conformati, pronti per la fase di radicazione; B) germogli piccoli, mantenuti in fase di moltiplicazione (Clone LIG15).
2a. Valutazione degli effetti vitaminici:
Una volta valutati i dati ottenuti con i sui substrati a base MS, la formulazione ormonale risultata più efficiente, sia dal punto di vista dei tassi di moltiplicazione che della qualità complessiva del germoglio, è stata testata su un substrato a base LS4. La formula, messa a punto da Linsmaier e Skoog nel 1965 per studiare le reali necessità di sostanze organiche nella coltura in vitro di tabacco, oltre a risultare più economica e di più facile preparazione, in quanto priva di alcune vitamine rispetto al substrato MS (glicina, acido nicotinico e piridossina cloridrato, oltre a una ridotta concentrazione di tiamina cloridrato, cfr. paragrafo 1.4), ha fornito buoni risultati sia in fase di moltiplicazione che di radicazione su genotipi di statice (Leshem e Cohen, 1983; Harazy et al., 1985).
Anche in questo caso sono stati valutati 6 germogli singoli per vaso, alla seconda subcoltura su substrato LS, con 9 ripetizioni per prova, utilizzando come controllo altrettanti vasi con identica formulazione ormonale su base MS. I parametri valutati sono gli stessi delle prove di valutazione degli effetti ormonali descritti al punto 1a.
Disegno sperimentale per le prove di radicazione in vitro:
1b. Valutazione degli effetti ormonali:
Sei cloni selezionati (gli stessi utilizzati nelle prove di moltiplicazione); 3 diversi substrati di moltiplicazione a base MS (formulati secondo le indicazioni ottenute dalle prove preliminari di radicazione); 6 germogli per vaso; 9 ripetizioni (vasi) per prova.
4 Linsmaier & Skoog Medium (Micro- e Macro elementi incluse vitamine) DUCHEFA.
Per ciascuna prova sono stati valutati i seguenti parametri: a. Percentuale di germogli radicati in vitro.
b. Percentuale complessiva di germogli radicati e con callo rizogeno, ritenuti idonei per il passaggio in fase di acclimatazione (solo se in presenza di bassa percentuale di radicazione).
c. Percentuale di di germogli vitrescenti e/o necrotici. d. Incremento giornaliero medio di biomassa (peso fresco).
e. Valutazione complessiva di tipo qualitativo dei germogli radicati, in particolare: - sviluppo e consistenza dell’apparato radicale;
- sviluppo e consistenza dell’apparato fogliare;
- presenza/assenza di callo, vitrescenza, fenomeni di imbrunimento e necrosi. 2b. Valutazione degli effetti vitaminici:
Come per le prove di moltiplicazione, una volta valutati i dati ottenuti con i sui substrati a base MS, la formulazione ormonale risultata più efficiente, sia dal punto di vista dei tassi di moltiplicazione che della qualità complessiva del germoglio, è stata testata su un substrato a base LS, al fine di valutare gli effetti della componente vitaminica. Sono stati valutati 6 germogli singoli per vaso, con 9 ripetizioni per prova, utilizzando come controllo altrettanti vasi con identica formulazione ormonale su base MS. I parametri considerati sono gli stessi delle prove di valutazione degli effetti ormonali descritti al punto 1b.
3.3.7. Prove preliminari di radicazione in vitro in presenza di ABA
Nell’autunno 2011 sono state intraprese delle prove sperimentali di radicazione in vitro al fine di verificare su Limonium gli effetti dell’acido abscissico (ABA) aggiunto ai mezzo di coltura sui meccanismi di regolazione dell’apertura degli stomi già descritti su altre specie, come discusso nel paragrafo 1.4 (Pospíšilová et al., 1999; Aguilar et al., 2000). Lo scopo è quello di riuscire a “indurire” i germogli durante la fase di radicazione, in modo da ridurre o eliminare del tutto la durata della successiva fase di ambientamento. Ciascuno dei 6 cloni selezionati è stato radicato sul substrato a base MS risultato più efficiente durante le prove di radicazione descritte nel paragrafo precedente, a cui è stato aggiunto ABA alla concentrazione di 10-4 M, in accordo con le prove effettuate da Aguilar et al. (2000) su Tagetes erecta. In due casi, LSB43 (Limonium del gruppo “statice”) e LIG15 (Limonium del gruppo “gmelinii/altaica”), è stata saggiata anche una concentrazione di ABA nel mezzo 10 volte più bassa (Tab. 7).
CLONI SUBSTRATI