(metodica proposta da Lin e Alfi nel 1976) (31)
- Soluzioni
1. Tampone di McIlveine a pH 7
acido citrico 0,63 g
fosfato di sodio bibasico (Na2HPO4) 6,19 g
acqua distillata 500 ml
2. Soluzione stock DAPI
DAPI (4’-6-diamidino-2-fenilindole) 1 mg.
acqua distillata 5 ml
questa soluzione può essere conservata in freezer per qualche mese in
vials scure.
3. Soluzione DAPI di lavoro
soluzione stock DAPI 50 µl
tampone di McIlvaine (pH 7) 15ml
questa soluzione è preparata fresca prima dell’uso.
4. Tampone fosfato di sodio a pH 11 (0,2 M)
fosfato di sodio bibasico (Na2HPO4) 2,8 g
acqua distillata 100 ml
- Procedimento
1. Mettere su ciascun vetrino alcune gocce di soluzione DAPI (1 µg/ml) e
coprire con un coprioggetto. Tenere per circa 10 minuti al buio a
tempera-tura ambiente.
2. Togliere il coprioggetto e lavare in acqua distillata, asciugare all’aria.
3. Coprire il vetrino con un coprioggetto mettendo tra i due il tampone
fosfato di sodio a pH 11 (0,2 M) ed eliminare l’eccesso. Esaminare al
microscopio in fluorescenza con una lunghezza d’onda di eccitazione
compresa tra 360 e 400 nm.
Figura 15. Caratteristiche della lampada utilizzata per radiare i preparati
nella colorazione per SCD e SCE.
Evidenziazione degli SCE mediante
anticorpi anti-BrdU
Una prima finalità della nostra ricerca è stata la messa a punto di una
nuova metodica per evidenziare gli SCE mediante l’utilizzo di
anticorpi-anti-BrdU. La tecnica utilizzata deriva da quella proposta per lo studio del
ciclo cellulare in colture di fibroblasti (33), dove gli anticorpi-anti-BrdU si
legano ai filamenti del DNA che hanno incorporato BrdU.
Contrariamente alle tecniche di sovracolorazlone con Giemsa, gli
anticorpi-anti-BrdU, danno una colorazione più intensa dei cromatidi
bisostituiti, rispetto ai monosostituiti con BrdU.
Una seconda finalità è stata di definire con maggiore precisione le regioni
cromosomiche che presentano gli SCE, mediante l’applicazione successiva
delle tecniche di bandeggio QFQ e delle tecniche per evidenziare gli SCE.
Nello studio dei cromosomi umani i materiali che vengono utilizzati e la
loro scelta, sono condizionati dal tipo di problematica che si vuole affrontare.
Il materiale più frequentemente usato per l’analisi cromosomica è il
san-gue periferico; con un prelievo di 0,5-1 ml si può allestire la coltura, dalla
quale si ottiene un numero di mitosi sufficiente per studiare il cariotipo
umano.
I linfociti presenti nel sangue periferico, sono le cellule sulle quali si può
agire per indurre l’attività mitotica in vitro, mediante l’aggiunta al mezzo di
coltura di fitoemoagglutirina (PHA), una sostanza che è capace di
trasfor-mare, in qualche ora, questi elementi cellulari in blasti capaci di una attività
proliferativa.
L’incubazione del sangue nel terreno di coltura, avviene alla temperatura
di 37°C per un periodo di 72 ore. Un’ora prima dello scadere di questo
periodo di incubazione, si aggiunge la colchicina, una sostanza estratta dalla
Colchicum Autumnale, che interferisce nella formazione del fuso mitotico e
blocca la mitosi in metafase.
Dopo centrifugazione, le cellule risospese in soluzione ipotonica
(solu-zione di cloruro di potassio 0,56% o 0,075 M), che favorisce con un effetto
osmotico la separazione dei singoli cromosomi e successivamente la rotture
delle membrane cellulari. Dopo 20 minuti in bagnomaria a 37° C e
succes-siva centrifugazione le cellule vengono quindi fissate con una soluzione di
acido acetico e alcool etilico (al posto dell’alcool etilico si può mettere anche
l’alcool metilico) nelle proporzioni di 1:3 per almeno 30 minuti. Dopo
ulteriori lavaggi in fissativo, vengono preparati i vetrini (stesura e squash),
successivamente si possono eseguire le varie colorazioni.
Per evidenziare gli SCE abbiamo seguito la metodica messa a punto da
Perry e Wolff (2), che prevede l’aggiunta di BrdU (concentrazione finale 10
µm) in coltura 24 ore prima dello scadere delle 72 ore.
Il procedimento successivo fino alla stesura dei vetrini è quello usato
normalmente. Numerosi sono i lavori che consigliano di procedere con la
colorazione per gli SCE subito dopo aver preparato i vetrini, noi abbiamo
eseguito questa colorazione anche dopo diversi giorni ottenendo ottimi
risultati.
I vetrini sono messi in Hoechst 33258 (0,5 mg/ml) per 15 minuti. L’azione
di questo colorante sarebbe di legarsi alla BrdU, modificando il successivo
legame con altri coloranti (Giemsa, arancio di acridina).
Si monta con coprioggetto, mettendo sul vetrino qualche goccia di
tampone fosfato a pH 6,8, sigillando per evitare l’evaporazione .
Si mette sotto una lampada ad ultravioletti ad una distanza di circa 10 cm
per un’ora; per evitare il surriscaldamento del vetrino, bisogna raffreddare i
vetrini con aria fredda.
Si rimuove il coprioggetto e si immerge in una soluzione 2xSSC (NaCl 0,3
M, citrato trisodico 0,03 M) in bagnomaria a 56°C per 20 minuti.
Risulta ora possibile, dopo un lavaggio in acqua corrente, colorare i
vetrini con Giemsa (al 5% in tampone fosfato a pH 6,8) per qualche minuto.
In alternativa si può effettuare una colorazione con coloranti fluorescenti
come l’arancio di acridina per 20 minuti.
Per la definizione delle bande cromosomiche in cui sono avvenuti SCE si
procede nel modo già descritto fino alla stesura dei vetrini, poi si esegue una
metodica di bandeggio in OFQ (84).
Dopo la fotografia dei vetrini, si procede con il processo di scolorazione,
che consiste nel lasciare i vetrini in alcool etilico a 95% per tutta la notte, poi
si applicano le tecniche di colorazione per gli SCE viste precedentemente
(15) (fig. 16).
- Immunofluorescenza con BrdU: metodica proposta
1. Preparazione dei vetrini nel modo descritto precedentemente.
2. Denaturazione in HCl 4 N per 30 minuti a temperatura ambiente e al
buio.
3. Disidratazione in etanolo 70-90-100% a -20°C, 5 minuti ogni passaggio.
4. Asciugare i vetrini aIl’aria.
5. Incubare in camera umida con anticorpo primario per 2 ore a 37°C in
termostato.
7. Incubare i vetrini con anticorpo secondario per 1 ora.
8. Fare 3 lavaggi di 5 minuti ciascuno in PBS 1x.
9. Disidratazione in etanolo 70-90-100%, ogni passaggio di 5 minuti a
temperatura ambiente.
10. Asciugare i vetrini all’aria.
11.Montare i vetrini con glicerolo-DABCO ed osservare al microscopio in
fluorescenza (360-400 nm).
Figure 16 A e 16 B. Stessa piastra metafasica fotografata in QFQ (a) e succ
-essivamente colorata per SCE con Heoechs 33258 e Giemsa (b).
Conclusioni
L’utilizzo dell’immunofluorescenza si è dimostrata una tecnica molto
vali-da per evidenziare SCD ed SCE consentendo una buona distinzione fra i
cro-matidi fratelli con livelli di intensità di fluorescenza soddisfacenti (fig. 17).
La migliore differenza di colorazione tra i due cromatidi (monosostituito
e bisostituito) consente di determinare con maggior precisione gli SCE,
anche in quelle zone (regioni terminali o paracentromeriche) in cui si hanno
scambi di piccole porzioni di cromatidio, oppure ancora, dove si verificano
doppi scambi che coinvolgono piccole regioni di cromatidio; queste zone con
altri coloranti a volte risultano di dubbia interpretazione (fig. 18-19).
L’osservazione dei preparati con immunofluorescenza è meno disturbata
da fluorescenze parassite di fondo che degradano l’immagine ottenuta con i
normali fluorocromi.
Ulteriori vantaggi dati dell’utilizzo di anticorpi-anti- BrdU rispetto
l’uti-lizzo di coloranti fluorescenti è di poter conservare i preparati anche per
diverso tempo (qualche mese a -20°C e al buio), i preparati si conservano
bene e sono anche protetti dal deterioramento causato dall’olio
d’immersio-ne, cosa che molte volte non risparmia nemmeno i vetrini colorati con
Giemsa.
Uno svantaggio del procedimento di immunofluorescenza e dato dal
maggior numero di passaggi richiesti e quindi dal tempo necessario rispetto
alla metodica tradizionale
La seconda finalità dello studio proposto, è stata di trovare una metodica
che potesse individuare con maggior precisione la banda cromosomica in cui
si è formato l’SCE. Dagli esperimenti condotti è emerso che sarebbe
preferibile eseguire prima il bandeggio cromosomico e poi effettuare la
ricerca degli SCE (fig. 16-20).
Sono state effettuate prove applicando le metodiche di bandeggio GTG o
QFQ poi, dopo scolorazione dei vetrini in alcool etilico (95%), si sono
ricercati gli SCE. L’utilizzo del bandeggio GTG e poi degli SCE non ha dato
risultati soddisfacenti, perché rimangono sempre tracce del bandeggio GTG
che può portare ad errore. Migliori risultati sono stati ottenuti applicando il
bandeggio QFQ, poi la ricerca degli SCE.
La valutazione delle frequenze di SCE rimane ancora oggi un valido
metodo per indagare danni reali o potenziali sul genoma: ogni
migliora-mento dell’evidenziabilità morfologica, come forse può attenersi attraverso
l’impiego di anticorpi contro BrdU potrà risultare utile in futuro.
Figura 17. Piastra metafasica dopo trattamento con anticorpi-antiBrdU.
Figura 18. Piastra metafasica dopo colorazione per evidenziare gli SCE con
Hoechst e arancio di acridina. Dopo due cicli con incorporazione di BrdU.
Figura 20. Piastra metafasica dopo colorazione per evidenziare gli SCD,
scolorata e bandeggiata in QFQ. Si possono osservare ancora ben evidenti
gli SCD. Assente il bandeggio.
Figura 19. Piastra metafasica dopo colorazione per evidenziare gli SCE con
Hoechst 33258 e arancio di acridina. Dopo 5 cicli cellulari con
incorporazione di BrdU.
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banded chromosomes. Hum. Genet. 1989; 81: 377-38
Indice
Editoriale ...pag. 3
Introduzione ... » 5
Sister Chromatid Differentiation ... » 6
1. Replicazione semiconservativa del DNA ... » 6
2. Modalità di evidenziazione della Sister Chromatid
Differentiation (SCD) ... » 10
Sister Chromatid Exchanges ... » 11
- Formazione degli SCE ... » 12
- SCE e crossing-over mitotico ... » 14
- Fattori che influenzano la formazione degli SCE ... » 15
a. Mutageni e clastogeni... » 18
b. Azione del fumo sugli SCE... » 22
c. Fattori geneticic. Fattori genetici ... » 22
d. Siti fragili, rotture cromosomiche ed SCE ... » 24
e. Sindrome di Prader Willi e SCE ... » 25
f. SCE e inattivazione del cromosoma-X ... » 25
Metodiche per evidenziare la SCD... » 26
A. Incorporazione della BrdU ... » 26
B. Metodica con Uridina ... » 26
C. Colorazione per fluorescenza con Hoechst 33258... » 27
D. Colorazione con Giemsa... » 28
E. Colorazione con DAPI ...» 29
Evidenziazione degli SCE mediante anticorpi anti-BrdU ... » 31
- Immunofluorescenza con BrdU: metodica proposta ... » 32
Conclusioni ... » 34
Bibliografia ... » 37
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