Classificazione delle proteine in base alla loro funzione
4.3 Conclusioni e prospettive
Differenze nelle condizioni d’acclimatazione al freddo durante i trattamenti, incluse sia quantità di luce che temperatura, spiegano probabilmente come mai, i risultati sugli studi fin’ora effettuati sulla tolleranza allo stress da congelamento in A. thaliana, differiscono leggermente tra loro. La ricchezza delle cellule vegetali di composti quali pigmenti, lipidi, polifenoli etc. inoltre, influisce negativamente sull’estrazione delle proteine e disturba l’elettroforesi in prima dimensione. Anche alla luce di queste considerazioni, è evidente come progressi e avanzamenti nelle tecniche d’indagine di questa disciplina, siano necessari al fine di garantire un buona estrazione proteica, ed analisi elettroforetiche attendibili ed affidabili.
L’obiettivo principale degli studi eseguiti sull’acclimatazione al freddo e sulla tolleranza allo stress da congelamento, prevede l’identificazione delle proteine indotte da queste condizioni, come queste vengono regolate, e che ruolo giocano nella vita delle piante alle basse temperature. La maggior parte degli studi che fino ad oggi sono stati effettuati sull’argomento, sono rappresentati soprattutto da lavori a livello genetico e trascrittomico. Con lo sviluppo delle tecnologie d’indagine proteomica, lo studio della
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risposta delle piante alle basse temperature e allo stress da congelamento, può pertanto essere inserito in un contesto d’analisi più ampio e possibilmente più esaustivo. I risultati ottenuti con lo studio dei pattern proteici, uniti ad indagini genetiche e trascrittomiche, offrono infatti la possibilità di analizzare e di comprendere meglio i meccanismi cellulari di difesa delle piante a questi stress, nonostante le limitazioni che le indagini proteomiche ancora possiedono.
Il presente lavoro, più che sul fenomeno dell’acclimatazione alle basse temperature in A.
thaliana, si è concentrato sulle risposte indotte dallo stress da congelamento in questa
specie vegetale. Tale approccio, è stato scelto per poter meglio analizzare tutti i cambiamenti che avvengono a livello proteico, in seguito a esposizioni sub-letali a –10 ºC, sia in piante acclimatate che in piante non acclimatate.
I risultati presentati in questo studio, hanno messo in luce come la regolazione dell’espressione proteica (up-regolation o down-regolation), rappresenta un importante mezzo d’adattamento delle piante alle basse temperature. Dalle nostre osservazioni infatti, risulta che molte delle proteine differenzialmente espresse analizzate, ricoprono ruoli importanti nella regolazione delle risposte di A. thaliana allo stress da congelamento. A supporto di tale considerazione, c’è il fatto che molte delle proteine identificate, sono risultate associate a svariati meccanismi e funzioni come difesa, sintesi proteica, trasduzione del segnale e fotosintesi, tutte vie, che come è stato descritto nei paragrafi precedenti, possono essere percorse dalla pianta in risposta allo stress da congelamento.
In particolare, sulla base dei dati ottenuti con il presente lavoro, è possibile ipotizzare per la fotosintesi, un ruolo di primo piano nelle risposte d’adattamento di A. thaliana allo stress da congelamento. Questa teoria, trova supporto e spiegazione sulla base delle osservazioni di seguito riportate:
•
gli incrementi nei livelli di espressione di una isoforma acida di Rubisco, sembrano imputabili al tentativo da parte di quest’ultima di utilizzare il potere riducente in eccesso causato dallo stress;•
contemporaneamente all’incremento nei livelli d’espressione di tale isoforma, si assiste ad una diminuzione nell’attività dell’isoforma RcaA2 di Rubisco Attivasi dovuta alla sua termosensibilità;•
aumenti relativi nell’attività dell’isoforma Rca1A1 sarebbero legati alla capacità di quest’ultimo enzima di legare più substrato;•
elevati accumuli di una specifica sub-unità del fotosistema II (OEE1), sarebbero capaci di contenere i livelli di fotoinibizione durante lo stress;•
diminuzioni a carico dell’altra sub-unità identificata (OEE2) solo nelle tesi NA+R, potrebbero essere indice di una maggiore sensibilità al congelamento, rispetto alle piante precedentemente acclimatate (4 ºC Accl).I risultati ottenuti con il presente lavoro, dimostrano e confermano la natura altamente complessa che sta alla base della capacità delle piante, di adattarsi a temperature basse e di congelamento. Attraverso l’impiego di ulteriori e sempre più affidabili sistemi d’indagine (per esempio Western Blot e Real Time PCR), sarà forse possibile rafforzare e completare i nostri dati, oltre che magari costruire uno schema dettagliato delle risposte indotte dalle basse temperature e dal congelamento nelle piante.
Aro E.M., Suorsa M., Rokka A., Allahverdiyeva Y., Paakkarinen V., Saleem A., Battchikova N., Rintamaki E. 2004. Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes. Journal of Experimental Botany
56(411):347-356.
Artus, N.N., Uemura, M., Steponkus, P.L., Gilmour, S.J., Lin, C.T., Thomashow, M.F. 1996. Constitutive expression of the cold-regulated Arabidopsis thaliana COR15a gene affects both chloroplasts and protoplasts freezing tolerance. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 93:13404-13409.
Ashworth, E.N., David, G.A., Wisiniewski, M.E. 1989. The formation and distribution of ice within dormant and deacclimated peach flower buds. Plant Cell and Environ.
12:521.
Baker, S.S., Wilhelm, K.S., Thomashow, M.F. 1994. The 5'-region of Arabidopsis thaliana cor15a has cis-acting elements that confer cold-, drought- and ABA-regulated gene expression. Plant Mol Biol 24:701-713.
Ballottari M., Dall’Osto L., Morosinotto T., Bassi R. 2007. Contrasting behaviour of higher plant photosystem I and II antenna systems during acclimation. J. Biol. Chem. 282:
8947-8958.
Bechtold, N., Ellis, J., Pelletier, G. 1993. In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C. R. Acad. Sci. Paris Sciences de la
vie/Life Sciences 316 :1194-1199.
Benedict C., Geisler M., Trygg J., Huner N., Hurry V. 2006. Consensus by democracy. Using meta-analyses of microarray and genomic data to model the cold acclimation signaling pathway in Arabidopsis. Plant Physiol. 141:1219-1232.
Borevitz J. O., Nordborg M. 2003. The Impact of Genomics on the Study of Natural Variation in Arabidopsis. Plant Physiology 132:718-725.
Bournay A.S., Hedley P.E., Maddison A., Waugh R., Machray G.C. 1996. Exon skipping induced by cold stress in a potato invertase gene transcript. Nucleic Acids Res.
24:2347-2351.
Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry
Burke, M.J., Gusta, L.V., Quamme, H.A., Weiser, C.J., Li, P.H. 1976. Freezing and injury in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. 27: 507-528.
Burke, M.J., Lindow, S.E. 1990. Surface properties and size and the icenucleation site in ice nucleation active bacteria: theoretical considerations. Cryobiol. 27:80-84.
Cánovas F.M., Dumas-Gaudot E., Recorbet G., Jorrin J., Mock H.P., Rossignol M. 2004. Plant proteome analysis. Proteomics, 4:285-298.
Chang, C., Bowman, J.L., DeJohn, A.W., Lander, E.S., Meyerowitz, E.M. 1988. Restriction fragment length polymorphism linkage map for Arabidopsis thaliana. Proc Natl
Acad Sci USA 85:6856-6860.
Chang, S. C., Par, S. K., Kim, B. C., Kang, B. J., Kim, D. U. et al. 1994. Stable genetic transformation of Arabidopsis thaliana by Agrobacterium inoculation in planta.
Plant J. 5:551-558.
Chinnusamy V., Ohta M., Kanrar S., Lee B.H., Hong X., Agarwal M., Zhu J.K. 2003. ICE1: a regulator of cold-induced transcriptome and freezing tolerance in Arabidopsis.
Genes Dev. 17:1043-1054.
Chinnusamy V., Zhu J., Zhu J.K. 2007. Cold stress regulation of gene expression in plants.
TRENDS in Plant Science Vol.xxx No.x.
Crafts-Brandner S.J., Van de Loo F.J., Salvucci M.E. 1997. The two forms of ribulose-1,5- bisphosphate carboxylase/oxygenase activase differ in sensitivity to elevated temperature. Plant Physiol. 114:439-444.
Danyluk, J., Sarhan, F. 1990. Differential mRNA transcription during the induction of freezing tolerance in spring and winter wheat. Plant Cell Physiol. 31:609-619.
De Nisi, P., Zocchi, G. 1996. The role of calcium in the cold shock responses. Plant Sci.
121:161-166.
Dowgert, M.F., Steponkus, P.L. 1984. Behaviour of the plasma membrane of isolated protoplasts during a freeze-thaw cycle. Plant Physiol. 75:1139-1151.
Gilmour S.J., Zarka D.G., Stockinger E.J., Salazar M.P., Houghton J.M., Thomashow M.F. 1998. Low temperature regulation of the Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional activators as an early step in cold-induced COR gene expression.
Gong Z., Lee H., Xiong L., Jagendorf A., Stevenson B., Zhu J.K. 2002. RNA helicase-like protein as an early regulator of transcription factors for plant chilling and freezing tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:11507-11512.
Gordon-Kamm, W.J., Steponkus, P.L. 1984. Lamellar-to-hexagonal II phase transitions in the plasma membrane of isolated protoplasts after freeze-induced dehydration. Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6373-6377.
Gorg A., Obermaier C., Boguth G., Harder A., Scheibe B., Wildgruber R., Weiss W. 2000. The current state of two dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients.
Electrophoresis 21:1037-1053.
Granvogl B., Plöscher M., Eichacker L. 2007. Sample preparation by in-gel digestion for mass spectrometry-based proteomics. Anal. Bioanal. Chem. 389(4):991-1002.
Guy C., Porat R., Hurry V. 2006. Plant cold and abiotic stress gets hot. Physiologia
Plantarum 126:1-4.
Gygi S.P., Rochon Y., Franza B.R., Aebersold R. 1999. Correlation between Protein and mRNA Abundance in Yeast. Molecular and Cellular Biology 3(19):1720-1730. Hannah M.A., Wiese1 D., Freund S., Fiehn O., Heyer A.G., Hincha D.K. 2006. Natural
Genetic Variation of Freezing Tolerance in Arabidopsis. Plant Physiology 142:98-
112.
Ideker T., Thorsson V., Ranish J.A., Christmas R., Buhler J., Eng J.K., Bumgarner R., Goodlett D.R., Aebersold R., Hood L. 2001. Integrated Genomic and Proteomic Analyses of a Systematically Perturbed Metabolic Network. Science 5518(292):929- 934.
Inouye D.W. 2000. The ecological and evolutionary significance of frost in the context of climate change. Ecol. Lett. 3:457-463.
Jaglo-Ottosen, K.R., Gilmour, S.J., Zarka, D.G., Schabenberger, O., Thomashow, M.F. 1998. Arabidopsis CBF1 overexpression induces COR genes and enhances freezing tolerance. Science 280:104-106.
Kendall, E.J., McKersie, B.D. 1989. Free radical and freezing injury to cell membranes of winter wheat. Physiol. Plant. 76: 86-94.
Knight, H., Trewavas, A.J., and Knight, M.R. 1996. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signature after acclimation.
Plant Cell 8:489-503.
Koornneef M., Alonso-Blanco C., Vreugdenhil D. 2004. Naturally occurring genetic variation in Arabidopsis thaliana. Ann. Rev. Plant Biol. 55: 141-172.
Lee B.H., Lee H., Xiong L., Zhu J.K. 2002. A mitochondrial complex I defect impairs cold regulated nuclear gene expression. Plant Cell 14:1235-1251.
Lee H., Xiong L., Gong Z., Ishitani M., Stevenson B., Zhu J.K. 2001. The Arabidopsis HOS1 gene negatively regulates cold signal transduction and encodes a RING finger protein that displays cold-regulated nucleo-cytoplasmic partitioning. Genes Dev.
15:912-924.
Levitt J. 1980. Responses of plants to environmental stress. In Chilling, Freezing, and High Temperature Stress. Vol 1, 2nd Edition. Academic Press.
Liu Q., Kasuga M., Sakuma Y., Abe H., Miura S., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. 1998. Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought and low-temperature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis. Plant Cell
10:1391-1406.
Lorimer G.H., Miziorko H.M. 1980. Carbamate formation on the epsilon-amino group of a lysyl residue as the basis for the activation of ribulosebisphosphate carboxylase by CO2 and Mg2+. Biochemistry 19(23):5321-5328.
Mann M, Jensen ON. 2001. Proteomic analysis of post-translational modifications. Nature
Biotechnology 21:255-261.
Meinke, D.W., Cherry, J.M., Dean, C., Rounsley, S.D., Koornneef, M. 1998. Arabidopsis
thaliana: A Model Plant for Genome Analysis. Science 5389(282):662-682.
Meyerowitz, E.M. and Somerville, C.R. 1994 Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory
Press New York.
Meyerowitz, E.M. 2001. Prehistory and History of Arabidopsis Research. Plant Physiology
Monroy, A.F., Sarhan, F., Dhindsa, R.S. 1993. Cold-induced changes in freezing tolerance, protein phosphorylation, and gene expression. Evidence for a role of calcium. Plant
Physiology 102:1227-1235.
Mortz E., Krogh T.N., Vorum H., Gorg A. 2001. Improved silver staining protocols for high sensitivity protein identification using matrix-assisted laser desorption/ionization- time of flight analysis. Proteomics 1:1359-1363.
Nam, H.G., Giraudat, J., den Boer, B., Moonan, F., Loos, W.D.B., Hauge, B.M., Goodman, H.M. 1989. Restriction fragment length polymorphism linkage map of Arabidopsis
thaliana. Plant Cell 1: 699-705.
Nussaume L., Harrison K., Klimyuk V., Martienssen R., Sundaresan V., Jones J.D. 1995. Analysis of splice donor and acceptor site function in a transposable gene trap derived from the maize element Activator. Mol. Gen. Genet 249:91-101.
O'Farrell P.H. 1975. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol.
Chem. 250:4007-4021.
Palta, J.P., Li, P.H. 1980. Alterations in membrane transport properties by freezing injury in herbaceous plants. Evidence against rupture theory. Physiol. Plant. 50:169-175. Parry M.L., Rosenzweig C., Iglesias A., Livermore M., Fischer G. 2003. Effects of climate
change on global food production under SRES emissions and socio-economic scenarios. Global Environ Change 14:53-67.
Portis A.R. Jr. 1992. Regulation of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase activity. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43:415-437.
Rabilloud T. 2002. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: old, old fashioned, but it still climbs up the mountains. Proteomics 2:3-10.
Rundle S.J., Zielinski R.E. 1991. Alterations in barley ribulose-1,5- bisphosphate carboxylase/ oxygenase activase gene expression during development and in response to illumination. J. Biol. Chem. 266:14802-14807.
Salvucci M. E., Ogren W. L. 1996. The mechanism of Rubisco activase: insights from studies of the properties and structure of the enzyme. Photosynth. Res. 47:1-11. Schneider, J.C., Nielsen, E., Somerville, C.R. 1995. A chilling-sensitive mutant of
Schweppe R.E., Haydon C.E., Lewis T.S., Resing K.A., Ahn N.G. 2003. The characterization of protein post-translational modifications by mass spectrometry.
Accounts of Chemical Research 36:453-461.
Steponkus P.L. 1984. Role of the plasma membrane in freezing injury and cold acclimation.
Ann. Rev. Plant Physiol. 35:543-584.
Steponkus, P.L., Stout, D.G., Wolfe, J., Lovelace, R.V.E. 1985. Possible role of transient electric fields in freezing-induced membrane destabilization. J. Membrane Biol.
85:191-199.
Steponkus, P.L., Uemura, M., Webb, M.S. 1993. Membrane destabilization during freeze- induced dehydration. Curr. Topics Plant Physiol. 10:37-47.
Steponkus, P.L., Uemura, M., Joseph, R.A., Gilmour, S.J., Thomashow, M.F. 1998. Mode of action of the COR15a gene on the freezing tolerance of Arabidopsis thaliana.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14570-14575.
Stone J.M., Palta J.P., Bamberg J.B., Weiss L.S., et al. 1993. Inheritance of freezing resistance in tuber-bearing solanum species: evidence for independent genetic control of non acclimated freezing tolerance and cold acclimation capacity. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90:7869-7873.
Tahtiharju, S., Sangwan, V., Monroy, A.F., Dhindsa, R.S., Borg, M. 1997. The induction of kin genes in cold-acclimating Arabidopsis thaliana. Evidence of a role of calcium.
Planta 203:442-447.
Teutonico R.A., Yandell B., Satagopan J.M., Ferreira M.E., Palta J.P., Osborn T.C. 1995. Genetic-analysis and mapping of genes-controlling freezing tolerance in oilseed
Brassica. Mol. Breed 1:329-339.
Thomashow M.F. 1990. Molecular genetics of cold acclimation in higher plants. In Scandalios J.G. (Ed.). Advances in genetics, genomic responses to environmental stress. Academic Press, New York 28:99-131.
Vincent D., Ergul A., Bohlman M.C., et al. 2007. Proteomic analysis reveals differences between Vitis vinifera L. cv. Chardonnay and cv. Cabernet Sauvignon and their responses to water deficit and salinity. Journal of Experimental Botany 58:1873-
1892.
Xiong L., Ishitani M., Lee H. and Zhu J.K. 1999. HOS5-a negative regulator of osmotic stress-induced gene expression in Arabidopsis thaliana. Plant J. 19:569-578.
Xiong L., Lee H., Ishitani M., Tanaka Y., et al. 2002. Repression of stress-responsive genes by FIERY2, a novel transcriptional regulator in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 99:10899-10904.
Zhang N., Portis A.R. Jr. 1999. Mechanism of light regulation of Rubisco: a specific role for the larger Rubisco activase isoform involving reductive activation by thioredoxin-f.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:9438-9443.
Zhu J., Shi H., Lee B.H., Damsz B., Cheng S., Stirm V., Zhu J.K., Hasegawa P.M., Bressan R.A. 2004. An Arabidopsis homeodomain transcription factor gene, HOS9, mediates cold tolerance through a CBF-independent pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA