FUTURI
Questo lavoro di tesi dimostra l'efficacia di una nuova tecnica, basata su tag corti di ultima generazione, per lo studio della dinamica di membrana del recettore neurotrofinico P75NTR in colture di cellule vive. Inizialmente sono state analizzate le proprietà di due derivati corti dell'ACP (A1 ed S6) sia sul
piano biochimico che su quello funzionale, utilizzando protocolli di western blot, di immunofluorescenza, e di controllo della palmitoilazione dei costrutti. Questi hanno mostrato come A1-P75NTR e S6-P75NTR non differiscano dalla
proteina endogena per quanto riguarda la maturazione, la traslocazione in membrana e, in generale, la natura del recettore. Successivamente si è focalizzata l'attenzione sull'idoneità di questi costrutti per studi a singola molecola, perciò essi sono stati clonati in un sistema di espressione inducibile e marcati con una strategia che prevede l'utilizzo di Quantum Dots e che ha permesso di visualizzare singole molecole di recettore tramite microscopia TIRF. Uno dei vantaggi dei protocolli utilizzati, che si evince dai risultati ottenuti, consiste nel controllo del livello di espressione del costrutto e quindi nella scelta della concentrazione di recettore ideale per evitare il molecular crowding, un fenomeno che, come osservato, inficia l'analisi delle traiettorie recettoriali. I risultati mostrati in questa tesi descrivono i risultati di SPT finora ottenuti con il recettore marcato con il tag A1; quelli relativi ad S6 sono ancora in fase di elaborazione, ma è verosimile
che anche in questo caso osserveremo una dipendenza della mobilità del recettore dalla dose di doxiciclina usata simile a quanto visto per il costrutto A1-P75NTR.
L’approccio descritto in questa tesi offre numerosi spunti di applicazioni future per investigare altrettanti problemi di natura biologica e biofisica riguardanti P75NTR. Uno dei primi passi auspicabili è sicuramente capire come varia la mobilità di membrana di P75NTR (qui presentata per il
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recettore in assenza di stimolazione) in risposta alla somministrazione dei diversi ligandi (neurotrofine e pro-neurotrofine) che sono noti legare P75NTR. Inoltre, questo lavoro è anche propedeutico per successivi studi di dual- color SPT: i tag A1 ed S6 possono infatti essere funzionalizzati con due
fluorofori differenti, grazie al fatto che la reazione di coniugazione a substrati derivati dal CoA è catalizzata, per i due tag, da due enzimi differenti. Quindi, usando uno dei due tag per visualizzare P75NTR, l’altro per marcare uno o più dei suoi interattori recettoriali di membrana (la serie di recettori Trk, sortilina, etc.), sarà possibile ricavare informazioni sulla loro dinamica di interazione. L’analisi potrà anche essere approfondita sfruttando una strumentazione che permetta di compiere studi a singola molecola in 3D. È chiaro che una porzione di membrana (come quella basale presa in esame in questo lavoro) può offrire moltissime informazioni sulla diffusività di un recettore, ma al fine di investigarne la mobilità in maniera più completa è auspicabile uno studio in tre dimensioni in modo da seguire processi di internalizzazione di recettori o di complessi recettoriali indotti da fenomeni di signalling o di recycling. Infine, un'ulteriore sviluppo sarà lo studio a singola molecola non solo della proteina full-length, ma anche delle sue possibili isoforme e/o forme mutate riscontrate in letteratura, con lo scopo di chiarire quali domini o porzioni della proteina siano responsabili dei diversi tipi di dinamica di P75NTR, e quindi di collegare questi alle sue diverse funzioni.
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ACRONIMI
NGF, Nerve Growth Factor
BDNF, Brain-Derived Neurotrophic Factor NT, Neurotrofina/e
NT-3, Neurotrophin-3 NT-4, Neurotrophin-4
Trk (A, B, C), Tropomyosin Receptor Kinase (A, B, C) P75NTR, P75 Neurotrophin Receptor
ICD, IntraCellular Domain CTF, C-Terminal Fragment
TNFR, Tumor Necrosis Factor Receptor UTR, UnTranslated Region
CRD, Cysteine-Rich Domain JM, Juxtamembranal Domain DD, Death Domain
CD, Chopper Domain
TRAF, TNFR associated factors
GIRK, G-protein-coupled inwardly rectifying potassium
Ptdins(4,5)P2, Phosphoinositide phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate
JNK3, c-Jun N-terminal kinases-3
NF-κB, Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells Sc-1, Schwann Cell Factor-1
Bex1, Brain expressed X-linked 1 PPT, Phosphopantheteinyltransferases
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Qdot, Quantum Dot
TRE, Tetracycline Response Elements LTR, Long Terminal Repeats
TIRF(M), Total Internal Reflection Fluorescence (Microscopy) MSD, Mean Square Displacement
eGFP, enhanced Green Fluorescent Protein mSEAP, Murine Secreted Alcaline Phosphatase HEK 293T/17, Human Embryonic Kidney T/17 PC12, Pheochromocytoma cells
DMEM, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium FBS, Fetal Bovine Serum
RPMI, Roswell Park Memorial Insitute Medium PBS, Phosphate Buffered Saline
RPM, Revolutions Per Minute RT, Room Temperature
RFPlam, Red Fluorescent Protein – laminina GFPfar, Green Fluorescent Protein – farnesile PFA, Paraformaldeide
BSA, Bovine Serum Albumin
RP, anti-P75NTR Rabbit Polyclonal IgG MM, anti-P75NTR Mouse Monoclonal IgG DAPI, 4',6-diamidino-2-phenylindole ON, Over Night
OM, Over Morning WB, Western Blot
TBST, Tris-Buffered Saline/Tween-20 ABE, Acyl Biotynil Exchange
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NEM, N-Ethylmaleimide
HA, Hydroxylamine (Idrossilammina) PIs, Protease Inhibitors
PMSF, Phenylmethanesulfonylfluoride CM, precipitazione in Cloroformio-Metanolo 4SB, 4% SDS Buffer
2SB, 2% SDS Buffer
CCD, charge coupled device ROI, Region Of Interest
DIC, Differential Interference Contrast IF, Immunofluorescenza
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BIBLIOGRAFIA
Allen SJ, Dawbarn D. (2006) Clinical relevance of the neurotrophins and their
receptors. Clin Sci (Lond).;110(2):175-91.
Barde I, Zanta-Boussif MA, Paisant S, Leboeuf M, Rameau P, Delenda C,
Danos O. (2006) Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Feb, Mol Ther.;13(2):382-90.
Berlucchi G, Buchtel HA. (2009) Neuronal plasticity: historical roots and
evolution of meaning. Jan, Exp Brain Res.;192(3):307-19.
Bernabeu RO, Longo FM (2010) The p75 neurotrophin receptor is expressed
by adult mouse dentate progenitor cells and regulates neuronal and non- neuronal cell genesis. (2010), BMC Neurosci.; 11:136.
Binder DK, Scharfman HE. (2004) Brain-derived neurotrophic factor. Growth
Factors.; 22(3):123-31.
Callegari A, Luin S, Marchetti L, Duci A, Cattaneo A, Beltram F. (2012) Single
particle tracking of acyl carrier protein (ACP)-tagged TrkA receptors in PC12nnr5 cells., J Neurosci Methods.; 204(1):82-6
Ceni C, Kommaddi RP, Thomas R, Vereker E, Liu X, McPherson PS, Ritter B,
Barker PA. (2010) The p75NTR intracellular domain generated by neurotrophin-induced receptor cleavage potentiates Trk signaling. J Cell Sci.; 123(Pt 13):2299-307
Chao MV, Bothwell MA, Ross AH, Koprowski H, Lanahan AA, Buck CR,
Sehgal A. (1986) Gene transfer and molecular cloning of the human NGF receptor. Science. 25;232(4749):518-21.
Chung I, Akita R, Vandlen R, Toomre D, Schlessinger J, Mellman I. (2010)
Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells. Nature.; 464(7289):783-7
Cohen S, Levi-Montalcini R, Hamburger V. (1954) A nerve growth-stimulating
factor isolated from Sarcomas 37 and 180. Oct, Proc Natl Acad Sci U S A.; 40(10):1014-8.
Cohen S, Levi-Montalcini R. (1956) A nerve growth-stimulating factor isolated
~ 104 ~
Cohen S, Levi-Montalcini R. (1957) Purification and properties of a nerve
growth-promoting factor isolated from mouse sarcoma 180. Jan, Cancer Res.; 17(1):15-20.
Colditz MJ, Catts VS, Al-menhali N, Osborne GW, Bartlett PF, Coulson EJ.
(2010) p75 neurotrophin receptor regulates basal and fluoxetine-stimulated hippocampal neurogenesis. Exp Brain Res.; 200(2):161-7
Coulson EJ, May LM, Osborne SL, Reid K, Underwood CK, Meunier FA,
Bartlett PF, Sah P. (2008) p75 neurotrophin receptor mediates neuronal cell death by activating GIRK channels through phosphatidylinositol 4,5- bisphosphate. J Neurosci. 2;28(1):315-24.
Domeniconi M, Zampieri N, Spencer T, Hilaire M, Mellado W, Chao MV,
Filbin MT. (2005) MAG induces regulated intramembrane proteolysis of the p75 neurotrophin receptor to inhibit neurite outgrowth. Jun 16, Neuron.; 46(6):849-55.
English AW, Cucoranu D, Mulligan A, Rodriguez JA, Sabatier MJ. (2011)
Neurotrophin-4/5 is implicated in the enhancement of axon regeneration produced by treadmill training following peripheral nerve injury. Eur J Neurosci.; 33(12):2265-71.
Feng D, Kim T, Ozkan E, Light M, Torkin R, Teng KK, Hempstead BL, Garcia
KC. (2010)Molecular and structural insight into proNGF engagement of p75NTR and sortilin. J Mol Biol.; 396(4):967-84. Epub 2009 Dec 28.
Fiore M, Chaldakov GN, Aloe L. (2009) Nerve growth factor as a signaling
molecule for nerve cells and also for the neuroendocrine-immune systems. Rev Neurosci.; 20(2):133-45.
Foehr ED, Lin X, O'Mahony A, Geleziunas R, Bradshaw RA, Greene WC.
(2000) NF-kappa B signaling promotes both cell survival and neurite process formation in nerve growth factor-stimulated PC12 cells. J Neurosci.; 20(20):7556-63.
Ghilardi JR, Freeman KT, Jimenez-Andrade JM, Coughlin KA, Kaczmarska
MJ, Castaneda-Corral G, Bloom AP, Kuskowski MA, Mantyh PW. (2012) Neuroplasticity of sensory and sympathetic nerve fibers in a mouse model of a painful arthritic joint. Arthritis Rheum.; 64(7):2223-32.
Gong Y, Cao P, Yu HJ, Jiang T. (2008) Crystal structure of the neurotrophin-3
and p75NTR symmetrical complex. Nature.; 454(7205):789-93. Epub 2008 Jul 2.
~ 105 ~
Hallböök F, Ibáñez CF, Persson H. (1991) Evolutionary studies of the nerve
growth factor family reveal a novel member abundantly expressed in Xenopus ovary. Neuron.; 6(5):845-58.
He XL, Garcia KC. (2004) Structure of nerve growth factor complexed with the
shared neurotrophin receptor p75. Science.; 304(5672):870-5.
Hempstead BL. (2006) Dissecting the diverse actions of pro- and mature
neurotrophins. Curr Alzheimer Res.; 3(1):19-24.
Ho R, Minturn JE, Simpson AM, Iyer R, Light JE, Evans AE, Brodeur GM.
(2011) The effect of P75 on Trk receptors in neuroblastomas. Cancer Lett.; 305(1):76-85.
Hofer M, Pagliusi SR, Hohn A, Leibrock J, Barde YA (1990). Regional
distribution of brain-derived neurotrophic factor mRNA in the adult mouse brain. EMBO J.;9(8):2459-64.
Ip NY, Ibáñez CF, Nye SH, McClain J, Jones PF, Gies DR, Belluscio L, Le
Beau MM, Espinosa R 3rd, Squinto SP, et al. (1992) Mammalian neurotrophin-4: structure, chromosomal localization, tissue distribution, and receptor specificity. Proc Natl Acad Sci U S A.; 89(7):3060-4.
Kasai RS, Suzuki KG, Prossnitz ER, Koyama-Honda I, Nakada C, Fujiwara
TK, Kusumi A. (2011) Full characterization of GPCR monomer-dimer dynamic equilibrium by single molecule imaging. J Cell Biol.; 192(3):463-80.
Shimazu K, Zhao M, Sakata K, Akbarian S, Bates B, Jaenisch R, Lu B.
(2006) NT-3 facilitates hippocampal plasticity and learning and memory by regulating neurogenesis. Learn Mem.; 13(3): 307–315.
Kenchappa RS, Zampieri N, Chao MV, Barker PA, Teng HK, Hempstead BL,
Carter BD. (2006) Ligand-dependent cleavage of the P75 neurotrophin receptor is necessary for NRIF nuclear translocation and apoptosis in sympathetic neurons. Neuron.; 50(2):219-32.
Kenchappa RS, Tep C, Korade Z, Urra S, Bronfman FC, Yoon SO, Carter
BD. (2010) p75 neurotrophin receptor-mediated apoptosis in sympathetic neurons involves a biphasic activation of JNK and up-regulation of tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme/ADAM17. J Biol Chem.; 285(26):20358-68.
Levi-Montalcini R, Cohen S. (1956) In vitro and in vivo effects of a nerve
growth-stimulating agent isolated from snake venom. Proc Natl Acad Sci U S A.; 42(9):695-9.
~ 106 ~
Maisonpierre PC, Belluscio L, Squinto S, Ip NY, Furth ME, Lindsay RM,
Yancopoulos GD. (1990) Neurotrophin-3: a neurotrophic factor related to NGF and BDNF. Science 247(4949):1446-51.
Martin-Zanca D, Hughes SH, Barbacid M. (1986) A human oncogene formed
by the fusion of truncated tropomyosin and protein tyrosine kinase sequences. Nature; 319(6056):743-8.
Martin-Zanca D, Oskam R, Mitra G, Copeland T, Barbacid M. (1989)
Molecular and biochemical characterization of the human trk proto-oncogene. Mol Cell Biol; 9(1):24-33.
McDonald NQ, Lapatto R, Murray-Rust J, Gunning J, Wlodawer A, Blundell
TL. (1991) New protein fold revealed by a 2.3-A resolution crystal structure of nerve growth factor. Nature 354(6352):411-4.
Nykjaer A, Lee R, Teng KK, Jansen P, Madsen P, Nielsen MS, Jacobsen C,
Kliemannel M, Schwarz E, Willnow TE, Hempstead BL, Petersen CM. (2004) Sortilin is essential for proNGF-induced neuronal cell death. Nature; 427(6977):843-8.
Paspala S, Murthy T, Mahaboob V, Habeeb M. (2011) Pluripotent stem cells -
a review of the current status in neural regeneration. Neurol India;59(4):558- 65.
Provenzano MJ, Minner SA, Zander K, Clark JJ, Kane CJ, Green SH,
Hansen MR. (2011) p75(NTR) expression and nuclear localization of p75(NTR) intracellular domain in spiral ganglion Schwann cells following deafness correlate with cell proliferation. Mol Cell Neurosci.; 47(4):306-15.
Rabizadeh S, Oh J, Zhong LT, Yang J, Bitler CM, Butcher LL, Bredesen DE.
(1993) Induction of apoptosis by the low-affinity NGF receptor. Science 261(5119):345-8.
Reichardt LF. (2006) Neurotrophin-regulated signalling pathways. Philos
Trans R Soc Lond B Biol Sci. 361(1473):1545-64.
Robinson RC, Radziejewski C, Stuart DI, Jones EY. (1995) Structure of the
brain-derived neurotrophic factor/neurotrophin 3 heterodimer. Biochemistry.; 34(13):4139-46.
Roux PP, Barker PA. (2002) Neurotrophin signaling through the p75
neurotrophin receptor. Prog Neurobiol.; 67(3):203-33.
Skeldal S, Matusica D, Nykjaer A, Coulson EJ. (2011) Proteolytic processing
of the p75 neurotrophin receptor: A prerequisite for signalling?: Neuronal life, growth and death signalling are crucially regulated by intra-membrane proteolysis and trafficking of p75(NTR). Bioessays; 33(8):614-25
~ 107 ~
Stein DG, Hoffman SW. (2003) Concepts of CNS plasticity in the context of
brain damage and repair J Head Trauma Rehabil.; 18(4):317-41.
Suzuki KG, Fujiwara TK, Edidin M, Kusumi A (2007) Dynamic recruitment of
phospholipase C gamma at transiently immobilized GPI-anchored receptor clusters induces IP3-Ca2+ signaling: single-molecule tracking study 2. J Cell Biol 177(4): 731-742
Szulc J, Wiznerowicz M, Sauvain MO, Trono D, Aebischer P. (2006) A
versatile tool for conditional gene expression and knockdown. Nat Methods.; 3(2):109-16.
Taupin P, Gage FH. (2002) Adult neurogenesis and neural stem cells of the
central nervous system in mammals. J Neurosci Res. 15;69(6):745-9.
Underwood CK, Reid K, May LM, Bartlett PF, Coulson EJ. (2008)
Palmitoylation of the C-terminal fragment of p75(NTR) regulates death signaling and is required for subsequent cleavage by gamma-secretase. Mol Cell Neurosci.; 37(2):346-58.
Wan J, Roth AF, Bailey AO, Davis NG. (2007) Palmitoylated proteins:
purification and identification. Nat Protoc.; 2(7):1573-84.
Wang KC, Kim JA, Sivasankaran R, Segal R, He Z. (2002) P75 interacts with
the Nogo receptor as a co-receptor for Nogo, MAG and OMgp. Nature; 420(6911):74-8.
Waterhouse EG, Baoji Xu. (2009) New insights into the Role of Brain-derived
Neurotrophic Factor in Synaptic Plasticity. Mol Cell Neurosci.; 42(2): 81–89.
Wehrman T, He X, Raab B, Dukipatti A, Blau H, Garcia KC. (2007) Structural
and mechanistic insights into nerve growth factor interactions with the TrkA and p75 receptors. Jan 4, Neuron.; 53(1):25-38.
Zhou Z, Cironi P, Lin AJ, Xu Y, Hrvatin S, Golan DE, Silver PA, Walsh CT,
Yin J. (2007) Genetically encoded short peptide tags for orthogonal protein labeling by Sfp and AcpS phosphopantetheinyl transferases. ACS Chem Biol.; 2(5):337-46.
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RINGRAZIAMENTI
Forse sembrerà scontato e banale iniziare così, ma voglio ringraziare con il cuore in mano due persone senza le quali non starei qui ora seduto a scrivere.
A te Stefano, che mi hai permesso di conoscere un mondo del tutto nuovo, misterioso e inaspettatamente bello; che sei rimasto fino a tardi in laboratorio per correggere la tesi togliendo del tempo alla tua famiglia e alla bellissima Eleonora; che hai sacrificato anche il week-end per rispondere alle mie
domande; che mi hai seguito; che mi hai insegnato con pazienza (nonostante spesso mi meritassi la gogna) e con rigore, che mi hai incitato ad
intraprendere un percorso che ho sempre visto come più grande di me e al di là delle mie possibilità; a te, grazie.
A te Laura, che giorno dopo giorno sei stata una maestra formidabile; che mi hai accompagnato passo dopo passo in questi lunghi mesi di lavoro; che hai dimostrato una disponibilità inaudita laddove la maggior parte delle persone avrebbe pensato agli affari propri; che sei stata severa ogni qual volta ce n'era bisogno; che sei stata comprensiva anche più di quanto mi meritassi; che hai saputo, sempre con un sorriso, rispondere ai miei milioni di dubbi; che mi hai incitato, anche tu, e mi hai dato coraggio nel percorrere un cammino che mai avrei immaginato.
Se oggi sono qui a discutere questo lavoro è merito vostro, che mi avete dato ciò che ogni studente vorrebbe. Non solo insegnanti, ma anche compagni, amici. A voi, grazie.
Ringrazio anche il Prof. Mario Pellegrino e la Prof.ssa Luciana Dente per i preziosi consigli dati sulla stesura di questo lavoro.
Un grazie anche ai Prof. Fabio Beltram e Antonino Cattaneo, senza i quali questa linea di ricerca non esisterebbe.
Ma questi mesi di gioie e dolori, trascorsi nei meandri del NEST, non
sarebbero stati gli stessi senza Gerardo, Lale, Dave, MaryG, Teresa, Marco P., Vale, Cristina e tutti gli altri. Perchè in fin dei conti un tirocinio non è solo duro lavoro, ma anche trascorrere del tempo insieme, maledire quegli
esperimenti che sembrano non avere un senso, cercare di interpretare quelle variabili che ti portano a simpatiche esclamazioni (per usare un eufemismo). Ogni volta che ne avevo bisogno, voi c'eravate. Perciò, grazie.
Ovviamente le lunghe giornate trascorse in laboratorio sono state dure e faticose, e senza un adeguato supporto esterno, adesso probabilmente sarei rinchiuso tra quattro mura bianche con la camicia di forza. Ringrazio quindi le persone che fanno parte della mia vita pisana. Stefano, che riesce sempre a vedere il lato positivo dove io vedo tutto nero e mi spinge a dare il meglio di
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me stesso. Rosy e Mari, con le quali potremmo prenderci a pugni ogni giorno e rimanere comunque legati; che mi hanno sempre spinto a credere in me stesso quando la mia fiducia calava a picco. Alfredo, dispensatore di affetto in dosi minime, ma che sa sempre dire le parole giuste al momento giusto, e quando vuole, sa come farsi voler bene. Lorenzo e Rossella, senza i quali le mie giornate a Mariscoglio sarebbero state noiose e piatte; persone affidabili, di buon cuore, che sanno come mettermi di buon umore. Coco e Ilaria, che con le loro paranoie mi hanno tormentato (scherzo) ma con le quali ho trascorso dei bei momenti. Le irriducibili secchione Claudia, Chiodo e Chiara B., che hanno reso le lezioni meno stressanti, meno pesanti e hanno
contribuito a renderle un punto di ritrovo tra amici. Enrico, quel tamarro livornese al quale, alla fine, ti affezioni. Cinzia, Diana, Lorenza, Caterina e Roberta, amiche canterine, ma persone sulle quali poter contare sempre. Andrea e Dani, amici che ho avuto il piacere di conoscere, purtroppo, da troppo poco tempo e con le quali ho trascorso delle serate indimenticabili. Tutti i coristi e gli amici (chi più, chi meno) che non ho nominato per via del mio Alzheimer giovanile, ma che irrimediabilmente mi hanno accompagnato in questi lunghi 5 anni in un'altra città. Sembra ieri quando sbarcavo a Pisa per la prima volta, e invece eccomi qui, a parlare di voi e di come sono felice di aver conosciuto persone meravigliose. A tutti voi, grazie.
Ma si sà, dopo lunghi periodi di assenza dalla tua città natale, la nostalgia ti pervade, e quando torni a casa trovi sempre persone pronte ad abbracciarti. E come non ringraziare Vale e Luigi, compagni da sempre, nonostante i round di litigi trascorsi sul ring dell'amicizia, persone con cui ho instaurato un
rapporto che spero non si deteriori, fedeli spalle, inseparabili compari di avventure. A voi, grazie.
Certo tornare a casa ti permette di trascorrere più tempo con gli amici che vedi dopo lunghi mesi di assenza. Ma è soprattutto il luogo dove ritrovi la tua famiglia, la tua base, il tuo punto di riferimento, il tuo mondo intimo, le persone che ti vogliono bene in maniera incondizionata, smisurata, a prescindere da tutto e da tutti. In primis le origini dei miei cromosomi sgangherati, i miei genitori, Giusi e Gianni, le persone che forse meritano dei ringraziamenti più di tutti. A voi che mi avete cresciuto con l'amore che solo dei genitori
meravigliosi possono dare; che avete sempre fatto degli enormi sacrifici per permettermi di studiare lontano e di trascorrere questi 23 anni in serenità, felicità, armonia, pace e benessere; che avete fatto di me la persona che sono oggi; che mi avete dato un'educazione formidabile; che siete tutto ciò di cui un figlio ha bisogno; che siete sempre pronti a tutto per me; sui quali posso contare in qualsiasi momento (anche se a volte ci teniamo il broncio come i bimbi piccoli); ai quali voglio un bene che non posso quantificare nemmeno coi saggi di laboratorio; a voi, che siete tutto per me, vi ringrazio di cuore. A Sabrina, che è forse l'anima più gemella che esista per me; con la
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quale abbiamo trascorso giornate nere e giornate luminose, litigi e risate a crepapelle; che nonostante tutto sarà sempre al mio fianco; una persona splendida, affidabile; che mi dà dei punti di vista ai quali non sarei mai arrivato; che mi ha guidato in questi anni universitari; che mi ha sempre sostenuto e incoraggiato a spingermi oltre i miei limiti; che ha sempre creduto e sempre crederà in me; più di una sorella; un'amica, la migliore; a te, che sei lontana, ma ti sento sempre vicina, grazie di cuore.
Ma i momenti di gioia non sono solo legati alla "famiglia" in senso stretto. Ci sono altre persone che contribuiscono a rendere migliori le tue vacanze. E quindi non posso non ringraziare i miei formidabili zii Marisa e Carmelo e la mia super-cugina Valeria, persone che rendono le mie giornate migliori; che mi fanno apprezzare quelle ore in cui stiamo insieme, anche se poche; che non sono qui oggi a vedere concluso questo percorso, ma che sento vicino; sui quali posso fare affidamento in qualsiasi momento; che mi hanno
cresciuto, coccolato e amato, e continueranno ad amarmi; le cui porte sono sempre aperte per me; a voi, che siete la mia seconda famiglia, un grazie di