Conferma di alcuni dei bersagli di PIK3CA mutato identificati con analisi microarray attraverso immunoistochimica e analisi Western blot.

Successivamente abbiamo confermato alcuni risultati ottenuti con la metodica microarray attraverso immunoistochimica. Come atteso, una forte immunoreattività per le proteine bersaglio di PIK3CA, FASN e SCD1, è stata evidenziata nelle lesioni preneoplastiche e nei tumori epatocellulari dei topi iniettati con il plasmide PIK3CA- E545K (Figura 13,14), mentre tali proteine erano scarsamente espresse nei fegati dei topi normali (dati non mostrati) ed in quelli dei topi iniettati con il vettore vuoto (Figura 12).

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Figura 12. I fegati dei topi iniettati con vettore vuoto mostrano scarsa

immunoreattività ai bersagli di PIK3CA. (A,B) Assenza di alterazioni istologiche di rilievo nei preparati colorati con ematossilina e eosina (HE) a minore e maggiore ingrandimento, rispettivamente. Il fegato dei topi iniettati con vettore vuoto (6 mesi dopo iniezione idrodinamica) non presenta, come atteso, positività alla colorazione per l’HA-tag, ossia il marcatore del plasmide PIK3CA, (C) e bassa immunoreattività per i bersagli molecolari di PIK3CAE545K (FASN è mostrato in D). Ingrandimento: x40 in A; x100 in B-D.

HE HE

HA-tag FASN

A B

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Figura 13. L’iniezione idrodinamica del gene PIK3CAE545K induce lo sviluppo di lesioni

preneoplastiche nel fegato di topo che esprimono elevati di FASN e SCD1. (A,B) A minore e maggiore ingrandimento si apprezza la presenza di lesioni preneoplastiche focali nel fegato di topo a partire da 3 mesi dopo iniezione idrodinamica. Le lesioni sono positive, a livello immunoistochimico, per il costrutto iniettato (indicato dalla positività alla colorazione per l’HA-tag; C) e per i bersagli molecolari di PIK3CAE545K (la colorazione per FASN e SCD1 è mostrata rispettivamente in D ed E). L’attività proliferativa delle lesioni è evidenziata dalla positività delle medesime alla colorazione nucleare per Ki67 (mostrato in F; le frecce indicano due figure mitotiche). Ingrandimento: x40 in A; x100 in B-F.

HE HE HA-tag

FASN SCD1 Ki67

A B C

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Figura 14. L’iniezione idrodinamica del gene PIK3CAE545K induce lo sviluppo di

carcinomi epatocellulari (HCC) nel fegato di topo che mostrano immunoreattività per FASN e SCD1. (A,B) A minore e maggiore ingrandimento si apprezza la presenza di HCC, che tendono ad espandersi nel fegato circostante (SL). Gli HCC iniziano a comparire nei topi ineittati con PIK3CAE545K a partire dal 5 mese dopo iniezione idrodinamica. La colorazione per il costrutto iniettato (HA-tag) è limitata alle cellule tumorali (C). Le lesioni tumorali sono costituite da epatociti maligni di grandi dimensioni e citoplasma chiaro, a causa dell’accumulo intracellulare di lipidi (D). Le lesioni sono positive, a livello immunoistochimico, per il costrutto iniettato (indicato dalla positività alla colorazione per l’HA-tag; E) e per i bersagli molecolari di PIK3CAE545K (la colorazione per FASN e SCD1 è mostrata rispettivamente in F e G). L’attività proliferativa delle lesioni maligne è dimostrata dalla positività alla colorazione nucleare per Ki67 (mostrato in H). Ingrandimento: x40 in A; x100 in B-G.

I livelli di FASN e SCD1, così come quelli di altri bersagli di PIK3CA (COX2 e ZIP4) sono stati valutati attraverso analisi Western blot dei fegati di topi iniettati con vettore vuoto, tessuti circostanti i tumori (lesioni preneoplastiche) ed i tumori. Come atteso, i livelli di FASN, SCD1, COX2 e ZIP4 erano più elevati nei tumori rispetto agli altri gruppi, mentre non erano visibili differenze tra i fegati dei topi iniettati con vettore vuoto ed i fegati circostanti i tumori (Figura 15). L’assenza di differenze tra gli ultimi

HE HE HA-tag HE

SL

HCC

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gruppi è presumibilmente dovuta alla presenza di ampie parti di tessuto sano nei fegati circostanti i tumori con conseguente annullamento delle differenze medesime.

Figura 15. (A) Analisi Western blot dei fegati iniettati con il vettore vuoto (Vettore), e

fegati circostanti i tumori ed i tumori dei topi iniettati con il plasmide PIK3CA-E545K. Da quattro a sette campioni per gruppo sono stati valutati. I risultati indicano un’elevata espressione, oltre che di PIK3CA, di FASN, SCD1, COX2 e ZIP4 nei tumori dei topi PIK3CA-E545K. (B) Colorazione al Rosso Ponceau che indica il caricamento di un’equivalente contenuto di proteine totali in ciascun campione .

Vettore SL Tumors PIK3CAE545K Vettore SL Tumors PIK3CAE545K PIK 3CA FASN SCD1 COX2 ZIP4 β-Actin

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4. Discussione

Alterazioni a livello della via di segnale PI3K/AKT/mTOR sono comuni a differenti tumori solidi, e la sua aumentata attivazione può essere il risultato di mutazioni a livello dei geni PI3K o AKT, della perdita di funzione della proteina PTEN, o dell’attivazione costitutiva dei recettori tirosin-chinasi a montwe di PI3K. La scoperta di biomarcatori, che possano funzionare da bersagli molecolari, per contrastare lo sviluppo e la progressione di differenti neoplasie, è di fondamentale importanza per lo sviluppo di nuovi farmaci di successo. Un biomarcatore può essere un gene mutato che comporta una alterazione oncogena nota, una proteina iperespressa oppure una proteina che riflette lo stato di attivazione di una specifica via di segnale (77). Le PI3K svolgono un ruolo importante nel cancro umano. Il gene che codifica la subunità p110α, PIK3CA, è spesso mutato nei più comuni tumori umani, tra cui il carcinoma della mammella, della prostata, del colon e dell'endometrio.

Mutazioni a livello di PIK3CA, comprese quelle che riguardano i domini catalitici ed elicoidali comportano numerose lesioni molecolari, le quali possono favorire la capacità oncogena di PIK3CA. Inoltre, tali mutazioni possono avere diversi ruoli funzionali, anche se non completamente definiti, e un comportamento clinico differente a seconda del tipo di tumore. Ad esempio, recenti studi hanno dimostrato che per quanto riguarda il cancro alla mammella, le mutazioni PIK3CA mostrano un esito diverso a seconda che il tumore sia positivo o negativo ai recettori degli estrogeni e se HER2 (recettore 2 per il fattore di crescita epidermico umano) è iper-espresso o amplificato rispetto a HER2- normale (78). Inoltre le mutazioni PI3KCA sono associate ad una bassa espressione di Ki67.

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Nel caso del carcinoma endometriale (EC), gli studi indicano alterazioni molecolari differenti rispetto al carcinoma non endometrioide (NEC). Il EC coinvolgere mutazioni a livello delle proteine PTEN, PIK3CA, K-ras, e β-catenina, e difetti nel meccanismo di riparazione del DNA. Invece il NEC, presenta principalmente alterazioni a livello di p53 (nel 90% dei casi) e sovraespressione del recettore per il fattore di crescita epidermico umano HER-2 (79).

Di recente sono stati identificati diversi bersagli della via PI3K/AKT capaci di promuovere la sopravvivenza cellulare. Tali substrati includono due componenti del macchinario della morte cellulare intrinseca, BAD, caspasi 9, fattori di trascrizione della famiglia forkhead, e una chinasi IKK, che regola il fattore di trascrizione NF-kB (80). Un recente studio ha mostrato, nel caso del carcinoma epatocellulare, fosforilazioni a livello delle chinasi a valle di PI3K, quali mTOR e P70S6 rispettivamente nel 15 e 45% dei casi di CE (81). Analisi biochimiche su cellule del carcinoma del colon-retto (CRC) hanno mostrato che PIK3CA mutante, regola selettivamente la fosforilazione di AKT e la trascrizione dei fattori forkhead FKHR e FKHRL1. Inoltre le mutazioni PIK3CA inducono l’attenuazione dell’apoptosi e facilitano l’invasione tumorale (82). Dalla letteratura si evince che il ruolo oncogeno di PIK3CA nell’induzione del CE rimane ancora poco definito. Tuttavia, attraverso gli esperimenti condotti nella presente ricerca si evidenzia che l’iperespressione del gene PI3KCA E545K ha indotto significative modificazioni morfologiche nel fegato dei topi sottoposti a trasferimento genico idrodinamico dimostrando quindi che l’introduzione della forma mutata è sufficiente per l’induzione della neoplasia epatica.

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In particolare, l’analisi microarray ha rivelato la presenza di una serie di geni alterati nelle lesioni preneoplastiche e nei carcinomi epatocellulari dei topi PIK3CA-E545K rispetto ai fegati di controllo.

Il presente studio fornisce dunque un dettagliato quadro dei meccanismi molecolari coinvolti nell’epatocancerogenesi indotta dall’oncogene PIK3CA. L'evidenza attuale indica che numerosi tumori epiteliali sono caratterizzati da una aumentata sintesi lipidica. A livello molecolare, l’aumentata lipogenesi comporta, nelle cellule neoplastiche, un'induzione progressiva dell’attività e dell’espressione di diversi enzimi lipogenici, come l’acido grasso sintetasi o FASN; ATP citrato liasi o ACLY; Acetil- CoA carbossilasi o ACC e stearoil-CoA desaturasi 1 o SCD1. Tali enzimi sono responsabili del metabolismo del glucosio, con conseguente sintesi degli acidi grassi. In particolare, FASN catalizza la condensazione del malonil-CoA per produrre il palmitato, mentre SCD1 catalizza la sintesi di acidi grassi monoinsaturi, utilizzati come substrati per la sintesi di trigliceridi, esteri del colesterolo e fosfolipidi (83-84). Recenti studi hanno mostrato una lipogenesi alterata, correlata con l’aggressività clinica del CE e l’attivazione della cascata PI3K/AKT/mTOR (85). Questi enzimi, sono attivati a livello trascrizionale dalla sterol regulatory element-binding protein (SREBP)1, dal liver X Receptor (LXR) alfa e beta, e dalla carbohydrate responsive element binding protein (chREBP) (86). Le SREBP svolgono importanti ruoli nella regolazione del metabolismo lipidico. Recenti studi hanno inoltre dimostrato che l’espressione di FASN è controllata anche da altri fattori di trascrizione, come le proteine della famiglia p53 e dalla proteina nucleare collegata alla lipogenesi, SPOT14, la quale risulta sovraespressa nei tumori della mammella (87). I livelli di espressione di SCD1 sono spesso elevati in diversi tipi

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di cancro. Alcuni studi, centrati sugli effetti indotti dall’inibizione di SCD1, sulla crescita del tumore, hanno mostrato una diminuzione modesta della crescita cellulare, delle cellule del carcinoma renale a cellule chiare (ccRCC) (88,89,90), delle cellule del carcinoma gastrico (91) e delle cellule tumorali del colon (92). Inoltre, è stato visto che in vitro, l’inibizione di SCD1 porta ad induzione di stress cellulare correlato al reticolo endoplasmatico e apoptosi nelle linee cellulari multiple (89,91). L’importanza della lipogenesi anomala nel cancro è sottolineata da una recente serie di dati che mostrano come la soppressione dei principali enzimi lipogenici sia in grado di ridurre fortemente la crescita di varie linee cellulari tumorali in vitro e di ridurre la tumorigenesi in vivo (93).

La valutazione del ruolo di FASN come eventuale oncogene metabolico sarà utile per fornire nuove informazioni in grado di correlare obesità, diabete di tipo 2, steatosi epatica non alcolica con l’epatocancerogenesi.

Altri importanti bersagli molecolari di PI3KCA, coinvolti nella trasformazione tumorale, sono l’enzima ciclo ossigenasi 2 (COX-2) e il trasportatore di zinco ZIP4. COX-2, è un enzima chiave per la sintesi dei prostanoidi il quale sintetizza il mediatore pro-infiammatorio PGE2. In alcuni studi è stato osservato un aumento dei livelli di COX-2 e PGE2 nei carcinomi colo rettali, i quali sono in grado di promuovere l’invasività, l’angiogenesi e il potenziale metastatico (94). L’espressione di COX-2 svolge un importante ruolo nella sopravvivenza delle cellule tumorali del colon in condizioni di ipossia (95). Nei modelli animali, così come nell’uomo, l’inibizione di COX-2 riduce in modo significativo lo sviluppo dei tumori del colon (96). Per quanto riguarda ZIP4, diversi studi indicano che il trasporto e il metabolismo dello zinco è

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associato con la progressione del cancro, soprattutto nel cancro al seno (97,98). Tuttavia, il meccanismo molecolare di come i trasportatori di zinco, regolino la crescita tumorale rimane poco chiaro. Inoltre altri dati, hanno dimostrato che la sovraespressione di ZIP4, è significativamente aumentata nella maggior parte delle linee di cellule di cancro pancreatico umano e nei campioni chirurgici di adenocarcinoma umano.

L’analisi di tali meccanismi sarà di indubbio aiuto per una migliore comprensione della patogenesi molecolare dell’epatocarcinoma e per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche contro questo tumore.

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