CONFRONTO DELLE POPOLAZION

Considerando che tutte le popolazioni sono distribuite in modo normale, come si può estrapolare anche dalla Tabella 5.1, è stato utilizzato il test di Fisher, per stabilire se esistesse una differenza significativa tra le popolazioni di Pisa e quelle di San Piero. La probabilità associata al test di Fisher applicato ai due gruppi è il seguente: Fibrinogeno p = 0,74, aPTT p = 0,89. Entrambe sono molto al di sopra del valore soglia prefissato p = 0,05 e ne consegue che per questi parametri i valori appartenenti alle popolazioni di Pisa e di San Piero a Grado non differiscono in modo statisticamente significativo e possono essere considerate simili.

Per i dati del PT, il valore di p associato al test di Fisher è p = 0,014, valore inferiore a quello soglia prestabilito p = 0,05. Ne consegue che in questo caso, la differenza tra i dati appartenenti alle popolazioni di Pisa e di San Piero a Grado è statisticamente significativa, quindi le due popolazioni non possono essere considerate simili.

5.4 DISCUSSIONE

Gli obiettivi di questo lavoro consistevano nel determinare nuovi intervalli di riferimento per i test PT, aPTT e Fibrinogeno, per i laboratori del Dipartimento di Clinica Veterinaria attivi fino al 2009, al fine di poterli confrontare con quelli già in uso nei suddetti laboratori, ed utilizzati anche per il laboratorio unico del Dipartimento, attivo dal 2010.

I due laboratori in esame utilizzavano le stesse metodiche d'esecuzione dei test, gli stessi reagenti e due diversi modelli di coagulometro, prodotti dalla stessa ditta e con il medesimo principio di funzionamento.

Per poter determinare dei nuovi intervalli di riferimento, si è reso necessario selezionare una popolazione di soggetti sani, per ogni laboratorio, su cui fosse stato eseguito il profilo coagulativo. La selezione è stata messa in atto, a partire dai dati presenti sul database del Dipartimento di Clinica Veterinaria, considerando i profili coagulativi eseguiti nel corso degli anni 2008 e 2009 al fine di avere un numero sufficientemente ampio di dati da analizzare. Da questi dati sono stati eliminati quelli appartenenti a specie diverse da quella canina, in quanto costituivano gruppi con numerosità troppo esigua per poter produrre risultati significativi. Successivamente sono stati eliminati i soggetti con valori evidentemente outliers. Sui gruppi residui, è stata attuata un’attenta valutazione delle cartelle cliniche, al fine di scegliere i cani che non presentavano segni di malattia al momento dell’esecuzione dei test, sulla base dei criteri descritti nel paragrafo 5.2.2. Gli intervalli di riferimento sono stati determinati tramite un’accurata analisi dei dati. Osservando la Tabella 5.5 risulta evidente come gli intervalli di riferimento definiti a partire dalle popolazioni selezionate nel presente studio siano piuttosto diversi da quelli già in uso nei laboratori.

In particolare risultano più ampi quelli del Fibrinogeno, più ristretti quelli dell’aPTT, e spostati verso valori più alti quelli del PT, per entrambi i laboratori.

Per quanto concerne il Fibrinogeno, la stima dei nuovi intervalli di riferimento è 100-447 mg/dL per il laboratorio di Pisa, 88-430 mg/dL per il laboratorio di San Piero a Grado, a fronte dell’intervallo in uso di 100-400 mg/dL. Si ottiene, quindi, un ampliamento di un intervallo di riferimento, già piuttosto ampio, che indica la possibilità di avere soggetti falsi positivi per questo test. D’altra parte, la determinazione del

quanto questo analita può essere soggetto ad alterazioni, sia per innalzamento che per diminuzione, dovute ad una serie di patologie non necessariamente correlate con problemi coagulativi. Tali patologie potrebbero non essere state rilevate dallo studio eseguito sulle cartelle cliniche dei pazienti, se pur indagate accuratamente.

E’ interessante, inoltre, la presenza di una differenza tra gli intervalli di riferimento stabiliti per i due laboratori in esame.

Per quanto riguarda l’aPTT, i dati ottenuti sono interessanti. Gli intervalli trovati risultano essere, infatti, più ristretti dal limite inferiore, da 9 secondi dell’intervallo in uso a 9,4 secondi per il laboratorio di Pisa e 10,3 secondi per il laboratorio di San Piero a Grado e, soprattutto, dal limite superiore, da 20 secondi dell’intervallo in uso a 18,8 secondi per il laboratorio di Pisa, e 19,1 secondi per il laboratorio di San Piero a Grado. Quest’ultima differenza ha una rilevanza clinica maggiore, in quanto le principali coagulopatie, sia ereditarie che acquisite, possono determinare un allungamento del Tempo di Tromboplastina Parziale attivata, ma non un accorciamento. La presenza di tale differenza potrebbe, quindi, condizionare la capacità del Medico Veterinario di distinguere gli animali sani da quelli potenzialmente affetti da un disturbo coagulativo. In particolare si potrebbero considerare sani animali che invece avrebbero un allungamento dell’aPTT, ovvero si potrebbero riscontrare falsi negativi. E’ interessante, inoltre, osservare che gli intervalli di riferimento stabiliti, sono diversi anche tra i due laboratori per lo stesso parametro, nonostante la similitudine tra le tecniche utilizzate.

Anche per quanto riguarda i dati relativi al PT, gli intervalli di riferimento trovati, si sovrappongono solo parzialmente a quello in uso, ma in questo caso, il limite superiore è maggiore di quello dell’intervallo

già esistente. I nuovi intervalli, infatti, sono 5,5-8,6 secondi per il laboratorio di Pisa, e 5,8-8,4 secondi per il laboratorio di San Piero a Grado, rispetto a 5,2-7,6 secondi dell’intervallo in uso. Per questo parametro, dunque, utilizzando l’intervallo di riferimento preesistente, il rischio è di avere un eccessivo numero di pazienti falsi positivi. Anche per questo parametro, inoltre, esiste una differenza tra l’intervallo trovato per il laboratorio di Pisa, e quello trovato per il laboratorio di San Piero a Grado.

Da quanto detto sopra, si può concludere che le differenze riscontrate tra i valori di riferimento in uso, e quelli rilevati a partire dalle popolazioni selezionate, indicano una reale possibilità di errore nell’interpretazione dei risultati dei test, e questo dato risulta maggiormente importante considerato che gli stessi intervalli sono tuttora utilizzati nel laboratorio attivo dal 2010. Questo si potrebbe potenzialmente riflettere sia sulla diagnosi clinica di coagulopatia e sulla relativa terapia, sia su decisioni in merito all’esecuzione di interventi chirurgici, nelle quali i risultati preoperatori del profilo coagulativo sono di fondamentale importanza. Le differenze tra i valori trovati per i due laboratori, inoltre, sono un ulteriore segnale dell’importanza di stabilire intervalli di riferimento specifici per i singoli laboratori. In questo caso, infatti, le similitudini tra i due laboratori sono molte, sia per gli strumenti utilizzati sia per le metodiche, ma in definitiva gli intervalli di riferimento sono diversi anche se lievemente.

Come detto nel paragrafo “risultati”, in seguito all’applicazione del test di Fisher alle popolazioni di San Piero a Grado e quelle di Pisa, per ogni parametro, è risultata una differenza statisticamente significativa solo per quanto riguarda il PT. Questo test, risulta essere, infatti, il più

sensibile tra quelli indagati, ma anche il più soggetto a variazioni anche a causa della ristrettezza dell’intervallo di riferimento.

Alla luce dei dati ottenuti, è possibile concludere che, ai fini di una corretta interpretazione dei risultati dei test, è corretto che ogni laboratorio stabilisca intervalli di riferimento propri, anche se gli strumenti sono spesso accompagnati da intervalli di riferimento prestabiliti dal costruttore. Inoltre tali intervalli dovrebbero essere monitorati, ed eventualmente corretti, con scadenze precise, nell’ambito di un piano di controllo di qualità interno al laboratorio. Il piano di controllo di qualità, oltre al monitoraggio degli intervalli di riferimento, dovrebbe comprendere il monitoraggio delle metodiche di esecuzione dei test, e quindi della fase analitica, ma anche della fase pre-analitica. Questo controllo può essere attuato, in parte, con la redazione e la rigorosa osservanza da parte di tutto il personale, di Procedure Operative Standard, riducendo al minimo, in questo modo, le fonti di errore dovute all’intervento umano.

BIBLIOGRAFIA

1) Lubas G. (2005). L’emostasi. In Appunti di ematologia clinica veterinaria: disordini dell’emostasi e medicina trasfusionale. 1° edizione, Servizio Editoriale Universitario di Pisa, pp 6-15.

2) Aguggini G., Beghelli V., Giulio L.F. (1998). Il Sangue. In Fisiologia degli animali domestici con elementi di etologia. 2° edizione, UTET, pp 311-356.

3) Smith S.A. (2010). Overwiew of hemostasis. In Schalm’s Veterinary Hematology. Ed. Weiss D.J., Wardrop K.J, 6° edizione, pp 635-653. 4) Moreno P., Ginel P. J. (1999). Effects of haemostasis, lipaemia, and

bilirubinaemia on prothrombin time, activated partial thromboplastin time and thrombin time in plasma samples from healty dogs. Res Vet Scie, 67, pp 273-276.

5) Lubas G., Caldin M., Wiinberg B.O., Kristensen A.T., (2010). Laboratory testing of coagulation disorders. In Schalm’s Veterinary Hematology. Ed. Weiss D.J., Wardrop K.J, 6° edizione, pp 1082-1100. 6) Stokol T., Brooks M.B. (2000). Effect of citrate concentration on

coagulation test results in dogs. JAVMA 217, pp 1672-1677.

7) Ceron J.J., Carli E., Tasca S. et al. (2008). Evaluation of EDTA haematology tubes for collection of blood samples for tests of secondary hemostasis in dogs. Am J Vet Res, 69, pp 1141-1147.

8) Iazbik C., Couto C.G., Gray T.L., Kociba G. (2001). Effect of storage conditions on hemostatic parameters of canine plasma obtained for transfusion. AJVR 62, pp 734-735.

9) Siegel J.E., Swami V.K., Glenn P., Peterson P. (1998). Effect (or Lack of it) of severe anemia on PT and aPTT Reults; Am J Clin Pathol, 110, pp 106-110.

10) Kolde H.J. (2004). Coagulation screening tests. In Haemostasis Phisiology, pathology, diagnostics. 2° edizione, Pentapharm Ltd, pp 78-89.

11) Stockham S. L., Scott M. A. (2002). Hemostasis. In Fundamentals of veterinary clinical pathology. 1° edizione, Iowa State Press, pp 155-226. 12) Mischke R., Nolte I. (1997). Optimization of prothrombin time

measurements in canine plasma; AJVR 58, pp 236-241

13) Mischke R. (2000). Activated partial Thromboplastin time as a screening test of minor or moderate coagulation factor deficiencies for canine plasma: sensitivity of different commercial reagents. J Vet Diagn Invest 12, pp 433-437.

14) Mischke R., Menzel D., Wolling H. (2000). Comparison of different methods to measure fibrinogen concentration in canine plasma with respect to their sensitivity towards the fibrinogen degradation products X, Y and D. Haemostasis, 30, pp 131-138.

15) Kolde H.J. (2004). The determination of fibrinogen and individual coagulation factors. In Haemostasis Phisiology, pathology, diagnostics. 2° edizione, Pentapharm Ltd, pp 90-101.

16) Gentry P.A. (2004). Comparative aspects of blood coagulation. J Vet, 168,pp 238-251.

17) Mineo K., Garabed R.B. (2007). Evaluation of a bench- top coagulation analyzer for measurement of prothrombin time, activated partial thromboplastin time, and fibrinogen concentrations in healthy dogs. AJVR, 68, pp 1342-1347.

18) Mischke R. (2001). Optimization of coagulometric tests that incorporate human plasma for determination of coagulation factor activities in canine plasma. AJVR, 62, pp 625-629.

19) Mischke R. (2002). Commercial variants of the prothrombin time test as a screening test of acquired coagulation factor II, VII e X deficiencies in dogs. Res Vet Scie, 73, pp 165-170.

20) Mischke R., Diedrich M., Nolte I. (2003). Sensitivitiy of different prothrombin time assays to factor VII deficiency in canine plasma. J Vet, 166, pp 79-85.

21) Stokol T. (2003). Plasma D-dimer for the diagnosis of thromboembolic disorders in dogs. Vet Clin North Am Small Anim Parct, 33, pp 1419- 1435.

22) Brooks M.B. (2010). Hereditary Coagulopathies. In Schalm’s Veterinary Hematology. Ed. Weiss D.J., Wardrop K.J, 6° edizione, pp 661-667.

23) Brooks M.B., De Laforcade A. (2010). Acquired coagulopathies. In Schalm’s Veterinary Hematology. Ed. Weiss D.J., Wardrop K.J, 6° edizione, pp 654-660.

24) Hackner S. G., Dallap Schaer B. (2010). Thrombotic disorders. In Schalm’s Veterinary Hematology. Ed. Weiss D.J., Wardrop K.J, 6° edizione, pp 668-678.

25) Stokol T. (2010). Disseminated intravascular coagulation. In Schalm’s Veterinary Hematology. Ed. Weiss D.J., Wardrop K.J, 6° edizione, pp 679-687.

26) Kljelgaard-Hansen M., Jensen A. L. (2010). Reference intervals. In Schalm’s Veterinary Hematology. Ed. Weiss D.J., Wardrop K.J, 6° edizione, pp 1034-1038.

27) Jensen A.L., Kljelgaard-Hansen M. (2010). Diagnostic test validation. In Schalm’s Veterinary Hematology. Ed. Weiss D.J., Wardrop K.J, 6° edizione, pp 1027-1033.

28) Kljelgaard-Hansen M., Jensen A. L. (2010). Quality control. In Schalm’s Veterinary Hematology. Ed. Weiss D.J., Wardrop K.J, 6° edizione, pp 1021-1026.

29) Klee G.G., Westgard J.O. (2008). Quality management. In Foundamentals of clinical chemistry. 6° edizione, TIETZ, pp 249-262. 30) Manuale d’uso Clot 2 SEAC®.

31) Manuale d’uso Clot 2S SEAC®. 32) Metodica PT SEAC®.

33) Metodica aPTT SEAC®.

34) Metodica Fibrinogeno SEAC®.

35) Geffré A., Friedrichs K., Harr K., Concordet D., Trumel C., Braun J. P. (2009). Reference Values: a review; Vet Clin Path, 38, pp 288-298

36) Miroslav K., Lamberson W. R. (2004). Estimation of parameters. In Biostatistics for animal science. CABI Publishing, pp 56-64.

37) Motta M. (1978).Analisi di varianza. Distribuzione F di Fisher. In Corso di biomatematica. Edagricole, pp169-174

38) Giavarina D., Dorizzi R.M., Guerra G. (2001). Linee guida per la produzione di intervalli di riferimento. Riv Med Lab JLM, 2, pp 99-105.

RINGRAZIAMENTI

Ringrazio il Professor George Lubas per i preziosi insegnamenti e per il supporto dato durante lo sviluppo di questo lavoro.

Grazie alla Dottoressa Anna Pasquini e alla Dottoressa Biancaurora Gigliucci per l’infinita pazienza e per la disponibilità .

Ringrazio la Dottoressa Alessandra Gavazza per aver cercato di insegnarmi un po’ di citologia.

Grazie a tutto il personale di laboratorio per l’immancabile gentilezza, e per avermi strappato un sorriso anche nelle giornate grigie.

Grazie a Martina, Chiara B., Karine, Veronica, Daniela, Chiara T. e Irene, per l’intenso scambio di e-mali, soprattutto per quelle non intitolate “turni”, e per gli apericena. E ringrazio Marianna, per il sostegno, per gli scarrozzamenti vari ed eventuali, e per le piccole follie.

Grazie a tutto lo staff Despy, che ha riempito gran parte delle mie estati, per le risate, le cene, le “ragiole” e gli “sbotti”, divenuti insostituibili ricordi. Un grazie speciale a Fede, per la sua immensa dolcezza, per l’innata solarità che fa stare bene chi le sta accanto, per la schiettezza e per esserci, sempre. Non posso non ringraziare gli amici dell’Elba, soprattutto quelli con cui sono cresciuta, perché è anche grazie a loro se sono quella che sono adesso.

Grazie a Beatrice, Marco e Claudio per i sabati spensierati quando più ne avevo bisogno.

Grazie a Lidia e Gavino, per avermi trattato fin da subito come una di famiglia.

Un immenso Grazie va alla mia Chiarina, anche se “grazie” non sarà mai abbastanza per l’Amica con la A maiuscola, che ha trovato sempre il giusto mezzo per starmi vicino e il tempo per ascoltarmi.

Un super grazie al mio fratellone Nicola e ad Azzurra, per avermi accolto sempre a braccia aperte nelle mie numerose fughe fiorentine, per avermi fatto sentire sempre, e dico sempre, come a casa, e per gli abbracci, che hanno un sapore nuovo e familiare allo stesso tempo.

Grazie ad Antonio per essermi stato sempre accanto anche nella lontananza, per avermi insegnato ad essere un po’ più paziente, per la sua razionalità, per la costanza e la coerenza e per avermi sopportato anche nei miei momenti peggiori.

Ringrazio con tutto il cuore e l’affetto che ho, i miei genitori, per avermi accompagnato e sostenuto durante tutto questo lungo cammino, senza mai avermi fatto pesare gli incidenti di percorso, il tempo che passava o i loro sacrifici, e per gli immancabili incoraggiamenti. Senza di loro non ce l’avrei fatta.