Alga saggiata Pseudokirchneriella Subcapitata Pseudokirchneriella Subcapitata
Durata del saggio 72 ore 72 ore
Condizioni di incubazione 24°C, costantemente illuminati e mantenuti in agitazione
24°C, costantemente illuminati e mantenuti in agitazione
Metodo di lettura dei saggi fluorimetro a fluorescenza λeccitazione:440
nm λemissione:670nm spettrofluorimetro λeccitazione:440 nm λemissione:670nm Valore di EC50 5,83 mg/L 3,67 mg/L Dimensioni n‐TiO2 25‐70 nm 15 nm
Fase cristallina n‐TiO2 99,5% anastasio 96% anastasio
Preparazione soluzione stock per ogni saggio:disperdere le n‐TiO2 nel
mezzo di nutrizione; sonicare per 30 minuti.
disperdere le n‐TiO2 in acqua Milli‐Q,
sonicare per 30 minuti. Conservare la soluzione per 1 mese (4°C al buio) e riutilizzare previa sonicazione per 30 minuti.
Preparazione alla lettura 50 μL di campione nelle piastre multi pozzetto, aggiungere 200 μL di etanolo. Lasciare riposare per 3 ore al buio prima di effettuare la lettura.
filtrare 10 mL di campione, macinare il filtro, aggiungere 15 mL di acetone. Lasciare a riposo per 3 ore in frigorifero, centrifugare ed estrarre il surnatante per la lettura.
Tab 5.10 Confronto tra i saggi condotti al CRSA e quelli di Aruoja et al., 2009
Aruoja et al., (2009) svolgono le letture dei saggi con il fluorimetro a fluorescenza; lo strumento, analogamente a quanto fatto per la lettura dei nostri test sperimentali, è settato su specifiche lunghezze d’onda di eccitazione ed emissione, pari rispettivamente a 440 e 670 nm.
Gli autori utilizzano nanoparticelle di Diossido di Titanio molto simili a quelle utilizzate nei saggi descritti in questo elaborato di tesi, sia per quanto riguarda le dimensioni (25‐70 nm quelle di Aruoja et al., 2009, 15 nm quelle fornite da ENEA Frascati ) sia per la fase cristallina (99,5% anastasio quelle di Aruoja et al., 2009, 96% anastasio quelle fornite da ENEA Frascati).
Differente è il trattamento della soluzione stock in quanto in Aruoja et al., (2009) viene preparata ogni qualvolta venga effettuato un saggio e prevede la dispersione delle nanoparticelle nel mezzo di nutrizione algale e successiva sonicazione per 30 minuti. La soluzione stock preparata per i nostri studi prevede la dispersione delle nanoparticelle in acqua Milli‐Q e sonicazione in bagno a ultrasuoni per 30 minuti, poi viene conservata per un mese in frigorifero (4°C al buio) in modo tale da poterla riutilizzare per lo svolgimento di 4 o 5 test, previa sonicazione per 30 minuti.
La specie algale utilizzata da Aruoja et al., (2009) è la stessa utilizzata nei nostri studi e lo stesso si può dire delle condizioni di mantenimento della subcoltura una volta che i campioni sono lasciati incubare per 72h (24°C, costantemente illuminati e mantenuti in agitazione); quello che distingue le due metodiche sperimentali è la preparazione dei campioni alla lettura strumentale.
Una volta trascorso il tempo di incubazione, Aruoja et al., (2009) trasferiscono 50 μL di campione nelle piastre multi pozzetto, aggiungono 200 μL di etanolo e lasciano riposare per 3 ore al buio prima di procedere con la lettura al fluorimetro a micropiastre; il metodo UNI 11006:2002 da noi applicato prevede invece la filtrazione di 10 mL di campione seguita da macinazione del filtro e aggiunta di 15 mL di acetone, prima di lasciare a riposo per 3 ore in frigorifero, dopodiché segue la centrifugazione e l’estrazione del surnatante per la lettura.
Nonostante queste differenze legate alla preparazione della soluzione stock e del campione prima della lettura della fluorescenza, i risultati dei due studi finora esaminati mostrerebbero come le nanoparticelle di dimensioni e composizione simile inducano sullo stesso organismo effetti negativi analoghi. Inoltre, i risultati ottenuti dai nostri test ecotossicologici, dimostrerebbero che il riutilizzo della soluzione stock, opportunamente sonicata e utilizzata in un arco di tempo non eccessivamente prolungato, possa garantire dei risultati soddisfacenti, se così si considerano quelli ottenuti da Aruoja et al., (2009).
I risultati ottenuti dai test sperimentali sono di un ordine di grandezza inferiore a quelli proposti da Warheit et al., (2007), i quali hanno effettuato saggi eco tossicologici su Pseudokirchneriella
Subcapitata ottenendo due valori di EC50 pari a 16 e 21 mg/L.
Warheit et al., 2007 Saggi al C.R.S.A.
Alga saggiata Pseudokirchneriella Subcapitata Pseudokirchneriella Subcapitata
Durata del saggio 72 ore 72 ore
Condizioni di incubazione 24°C, costantemente illuminati e
mantenuti in agitazione
24°C, costantemente illuminati e mantenuti in agitazione
Metodo di lettura dei saggi conta cellulare conta cellulare
Valore di EC50
ENPs fini: 16 mg/L
ENPs ultrafini: 21 mg/L 2,09 mg/L
DLS ENPs fini: 380 nm
ENPs ultrafini: 140 nm 180 nm
Preparazione soluzione stock per ogni saggio:disperdere le n‐ TiO2 in acqua a 12°C senza procedere con la sonicazione. disperdere le n‐TiO2 in acqua Milli‐Q, sonicare per 30 minuti. Conservare la soluzione per 1 mese (4°C al buio) e riutilizzare previa sonicazione per 30 minuti. Tab 5.11 Confronto tra i saggi condotti al CRSA e quelli di Warheit et al., 2007
Il primo valore di EC50 si riferisce agli effetti indotti da nanoparticelle fini di Diossido di Titanio
(dimensione media delle particelle disperse in acqua, DLS: 380 nm) con elevata percentuale di anastasio (99 %), il secondo da n‐TiO2 ultrafini (DLS: 140 nm) ma con solo il 21% di anastasio nella
fase cristallina. Le nanoparticelle utilizzate nei nostri saggi sono affini alle ENPs fini di Warheit et al., (2007) per quanto riguarda la fase cristallina (96% anastasio), e a quelle ultrafini se si considerano le dimensioni (DLS: 180 nm). Probabilmente, il valore di EC50 più tossico è attribuito
alle nanoparticelle di dimensioni maggiori (ENPs fini) perché la loro composizione presenta una percentuale di anastasio molto più elevata (99 %) rispetto quella delle ENPs ultrafini (21 %) [Hartmann et al., 2010; Warheit et al., 2007; Aruoja et al., 2009].
Inoltre Warheit et al., (2007), durante la procedura di preparazione della soluzione stock, disperde le n‐TiO2 in acqua a 12°C senza procedere con la sonicazione; in base a quanto descritto da Aruoja
et al., (2009), una volta sonicata, la sospensione diventa omogenea, torbida e senza particelle sedimentate sul fondo. Il bagno ad ultrasuoni risulterebbe quindi una metodica efficace per rompere gli aggregati di nanoparticelle, nonostante non si abbia conferma strumentale [Zhang et Sun et al., 2006]. L’eventuale formazione di aggregati nella soluzione stock preparata da Warheit et al., (2007), aumenterebbe le dimensioni delle n‐TiO2 in soluzione (ordine dei micron) e quindi
ridurrebbe la superficie esposta e, di conseguenza, la reattività chimica delle ENPs sulle cellule algali [Wang et al., 2008]; questa potrebbe essere la ragione per cui i valori di EC50 riportati sono
più elevati rispetto a quelli ottenuti dai nostri studi e da quelli di Aruoja et al., (2009).
Ad ogni modo, confrontando le nostre tecniche di preparazione e il mantenimento della cultura algale con quelle proposte da Warheit et al., (2007), non sono state individuate altre differenze evidenti; gli autori seguono la procedura descritta dal metodo OECD 201 che, analogamente alla norma UNI EN ISO 8692:2005, prevede la crescita della subcultura in un idoneo mezzo di nutrizione mantenendo costanti i parametri di incubazione quali temperatura, luce e agitazione. Una volta trascorse le 72 ore, l’endpoint viene letto attraverso la conta cellulare, la stessa metodica svolta al termine dei nostri saggi.