Correlazione della posizione degli stiletti rispetto all’onda EPG-DC 1 e

I tentativi di taglio, peraltro estremamente difficili da realizzare, dell‟apparato boccale di S.

pyri, per individuare la posizione degli stiletti in rapporto al tipo di onda hanno permesso di

illustrare la loro posizione rispetto all‟onda 2 o fase 3 attraverso l‟osservazione di 4 preparati. L‟identificazione esatta della posizione degli stiletti all‟interno dei tessuti fogliari è risultata estremamente difficoltosa sia a causa della difficoltà nel taglio dell‟apparato boccale di S. pyri sia per le ridotte dimensioni dello stiletto all‟interno del tessuto fogliare e per il distacco dalla resina (fig. 10; fig. 11).

Dalle osservazioni del percorso e della posizione degli stiletti, relativi all‟onda 2 si può evidenziare come l‟entrata di questi nell‟epidermide avvenga attraverso la perforazione delle cellule. Dei quattro preparati ottenuti la perforazione epidermica è stata osservata solo in tre poiché in un caso si è potuto osservare lo stiletto già all‟interno del tessuto fogliare. Nei tre preparati si osserva chiaramente la perforazione epidermica (fig. 12 b; fig. 12 c; fig. 12 d) da parte degli stiletti che avviene con asse inclinato degli stessi rispetto alla superficie fogliare e che avviene attraverso le singole cellule epidermiche, escludendo in maniera chiara la produzione di guaina salivare attorno agli stiletti stessi. Interessante un dettaglio visibile dalle immagini che riguarda l‟epidermide inferiore delle foglie di pero, ricoperta superficialmente da un sottile strato di cera. In uno dei tre preparati (fig. 12 a; fig. 12 b) si osserva in sequenza l‟avvicinamento degli stiletti all‟epidermide in corrispondenza di una struttura simile ad uno stoma. Non è infatti chiaro se il passaggio degli stiletti avvenga in una cellula di guardia rispetto ad una cellula epidermica.

Il percorso degli stiletti all‟interno del mesofillo fogliare (fig. 13 a; fig. 13 b; fig. 13 c; fig. 13 d) continua, nei quattro casi esaminati, attraversando il tessuto parenchimatico lacunoso, che solo comprende metà dello spessore di tutto il mesofillo. Tutti gli stiletti osservati si sono spinti in profondità all‟interno del tessuto parenchimatico lacunoso oltrepassando rapidamente l‟epidermide e spingendosi in tutti i casi in profondità rispetto allo strato epidermico.

Gli stiletti in tutti i casi esaminati effettuano un percorso leggermente ricurvo, che varia progressivamente l‟inclinazione rispetto a quella che si osserva al momento della perforazione del tessuto epidermico. Come all‟inizio della penetrazione anche a profondità maggiori, all‟interno del tessuto lacunoso, si nota attorno agli stiletti l‟assenza di guaina salivare. Nel loro percorso all‟interno del parenchima lacunoso oltrepassano sia gli spazi intercellulari che le cellule, dimostrando in questo modo di non svolgere una selezione nella scelta del tragitto che comprende tutti gli elementi costitutivi del tessuto parenchimatico lacunoso. Le immagini illustrano bene questi aspetti, dato che si può osservare il passaggio dello stiletto durante la penetrazione di una cellula in una foto (fig. 13 d) e la traccia lasciata dal suo passaggio all‟interno di una cellula nelle altre immagini (fig. 13 e; fig. 13 f). Le altre figure (fig. 13 a; fig. 13 b, fig. 13 c) illustrano il passaggio degli stiletti negli spazi intercellulari.

L‟osservazione della posizione degli stiletti di S. pyri all‟interno della foglia ed in relazione all‟onda 2, nei casi studiati, si conclude con la porzione apicale all‟interno del mesofillo fogliare (fig. 14 a; fig. 14 b; fig. 14 c). In due casi si può affermare che essi si spingono fino all‟altezza del fascio cribro-vascolare e in altri due casi più in profondità ma non oltrepassando lo strato del parenchima lacunoso. Questi quadri morfologici permettono di stabilire in modo definitivo che per quanto riguarda l’onda 2 la tingide non manifesta una specializzazione nella scelta dei tessuti. Interessante notare che non si osserva il passaggio degli stiletti oltre il livello dei fasci vascolari, che coinvolge pertanto lo strato del parenchima lacunoso fin quasi adiacente al suo strato inferiore.

Nei due casi in cui l‟apice dello stiletto giunge all‟altezza dei fasci vascolari si osserva che il percorso si conclude in un caso tra due fasci (fig. 14 c) mentre nell‟altro proprio a contatto di una cellula appartenente al fascio vascolare.

In tutti i casi, tranne uno, lo stiletto attraversa per intero la sezione del parenchima lacunoso e si osserva il suo passaggio sia all‟interno degli spazi aeriferi sia attraverso le cellule parenchimatiche (fig. 13 c; fig. 13d) portandosi all‟altezza dei fasci vascolari. Solo in un caso lo stiletto conclude il suo percorso prima di giungere nella zona interessata dal passaggio dei fasci (fig. 14 b). Dei tre stiletti che si spingono nella regione dei fasci vascolari, due concludono il percorso in prossimità dei fasci stessi, nelle cellule che avvolgono il floema, mentre uno all‟interno di uno spazio aerifero (fig. 15 a).

Posso pertanto sostenere che la fase riconducibile all‟onda 2 non si manifesta in un solo tipo di tessuto fogliare ma si esplica sia all‟interno delle cellule sia negli spazi aeriferi.

L‟analisi dei campioni ha permesso di sottolineare un aspetto molto importante inerente il comportamento alimentare di S. pyri. Questo fitofago è adattato ad alimentarsi dalla pagina inferiore della foglia di Pyrus communis, non solo per una maggior protezione da parte della foglia quando l‟insetto permane sulla pagina inferiore, ma per le caratteristiche morfologiche della parte inferiore della foglia, come si osserva in fig. 16 a e fig. 16 b. .

I fasci vascolari come illustra molto bene l‟immagine della foglia vista in sezione trasversale si caratterizzano per una disposizione spaziale tale da porre il floema, più ricco di sostanze nutritive, rivolto verso la pagina inferiore mentre lo xilema, più povero è rivolto verso la pagina superiore. Inoltre il floema si pone ad un livello di profondità che, sulla base delle informazione ottenute dagli esperimenti, è stato raggiunto visto che la sua localizzazione si pone entro il livello del tessuto parenchimatico lacunoso il quale è stato, come si è visto, superato quasi del tutto dal percorso degli stiletti. In relazione all‟onda 2 non emergono informazioni sui tessuti coinvolti dal passaggio degli stiletti che facciano pensare ad un coinvolgimento dei tessuti del parenchima a palizzata e dell‟epidermide superiore.

Le indagini eseguite attraverso l‟impiego della microscopia ottica sono state affiancate da quelle della microscopia elettronica a trasmissione. Come testimoniano le immagini (fig. 15 a; 15 b; 15 c; 15 d) posso escludere completamente la presenza di guaina salivare ed anche di eventuali tracce di una possibile emissione di saliva, non viste attraverso le immagini della microscopia ottica, che in qualche modo vada a ricoprire gli stiletti durante la sua penetrazione. Inoltre anche le immagini ottenute con impiego della microscopia elettronica illustrano, con maggior dettaglio, le osservazioni ed i risultati raggiunti con la microscopia ottica relativi al comportamento alimentare di S. pyri in relazione all‟onda 2 che si è rivelata essere non specifica verso un solo tipo di tessuto o di spazio intercellulare. Si può osservare molto bene il passaggio degli stiletti all‟interno delle cellule parenchimatiche prima di concludere il tragitto nello spazio intercellulare del parenchima lacunoso, caso osservato già in microscopia ottica e che si aggiunge, come detto, agli altri due casi in cui gli stiletti terminano il tragitto o all‟interno di cellule in prossimità dei fasci vascolari o tra due fasci.

Attraverso le immagini ottenute con l‟impiego della microscopia ottica ed elettronica ho potuto osservare, in sezione trasversale, anche la conformazione esterna ed interna degli stiletti di S.

pyri. Le immagini ottenute prima che gli stiletti penetrino nella foglia (fig. 15 d) evidenziano molto

bene la struttura interna ovvero le lamine mandibolari e le lamine mascellari, unica vera caratteristica che accomuna gli appartenenti a questo Ordine. Mandibole e mascelle, trasformate in

fini stiletti, risultano per questa specie entrambe di notevoli dimensioni e vanno a costituire il canale alimentare ed il canale salivare, ambedue con un diametro simile e di notevole ampiezza.

La doccia del labium, conosciuto comunemente come rostro, luogo deputato all‟alloggio degli stiletti, dall‟immagine e dalle altre sezioni effettuate non appare visibile, essendo posto a monte rispetto alle porzioni studiate. La struttura della porzione terminale, come si vede chiaramente dall‟immagine (fig. 15 a), si compone degli stiletti mandibolari che esternamente avvolgono quelli mascellari più sottili e si caratterizza per la presenza di seghettature poste sulla superficie esterna delle mandibole.

5765 5766 5767 5768 5769 5770 5771 5772 5773 5774 5775 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 Onda 1 Onda 2

Taglio apparato boccale

Fig. 10: Grafico EPG illustrante le onde 1 e 2, la linea rossa segna il passaggio dall‟onda 1 all‟onda 2. Il taglio dell‟apparato boccale deve avvenire in una fase precisa. Fig. 11: un particolare della resina con inclusa la porzione di foglia contenente gli stiletti recisi dal microbisturi elettrico, immagine ottenuta grazie all‟utilizzo dello stereomicroscopio.

Fig. 12: a partire da in alto a sinistra (fig. 12a) sezione trasversale di stiletto in prossimità di due cellule di guardia; il passaggio all‟interno di una cellula di guardia (fig. 12b); sezione trasvesrsale degli stiletti nella fase di perforazione della cuticola (fig. 12 c; fig. 12 d).

Fig 13: a partire da in alto a sinistra il percorso degli stiletti in profondità (fig. 13 a; fig. 13 b; fig. 13 c). In tre immagini (fig. 13 d; fig. 13 e; 13 f) lo stiletto perfora una cellula parenchimatica nella prima foto e lascia invece la traccia del suo passaggio nelle altre due immagini; si può notare (fig. 13 e) la particolare conformazione esterna dello stiletto con le dentellature.

Fig. 14: da sinistra tre immagini rappresentanti la porzione terminale dello stiletto. Le immagini indicano il termine del percorso dello stiletto tra due fasci vascolari ( 14 a), in prossimità di un fascio vascolare ( 14 b) ed all‟interno di uno spazio aurifero del parenchima lacunoso (14 c).

Fig. 15: da sinistra porzione terminale degli stiletti in sezione longitudinale in microscopia elettronica, caratterizzata dalla presenza di seghettature sulla superficie esterna delle mandibole e confluente all‟interno di uno spazio aerifero del parenchima lacunoso (15 a; 15 b); conformazione interna degli stiletti in sezione longitudinale (.fig. 15 c) che evidenzia la dislocazione delle lamine mascellari, all‟interno, e delle lamine mandibolari all‟esterno. L‟immagine di microscopia ottica (.fig. 15 d) illustra la conformazione interna dell‟apparato boccale della tingide trasversalmente fuori del tessuto vegetale. Come le altre esclude presenza di guaina salivare posta esternamente agli stiletti. In sezione trasversale appare facilmente visibile al centro la presenza di due canali ovvero quello salivare (con diametro leggermente più piccolo) e quello alimentare. Sono visibili in giallo le lamine mandibolari (esterne) e quelle mascellari, in blu si nota la muscolatura che permette agli stiletti di eseguire movimenti di avanzamento e di ritiro nel tessuto fogliare. Sono inoltre visibili quattro piccoli fori rappresentativi dei condotti percorsi dai nervi.

Fig. 16: da sinistra sezione di foglia di Pyrus communis (16 a); schema della sezione fogliare di Pyrus communis (16 b) dove in verde militare viene indicato il doppio strato di parenchima a palizzata che contraddistingue questa specie e presente sotto la pagina superiore della foglia. In azzurro lo strato di parenchima lacunoso, in marrone i fasci vascolari di tipo xilematico, in verde i fasci vascolari di tipo floematico, rivolti verso la pagina inferiore della foglia da dove si alimenta S. pyri. In rosso la profondità di penetrazione degli stiletti all‟interno del mesofillo fogliare osservata nella mia ricerca.

4.2 Confronto delle fasi individuate e dei parametri osservabili con l’EPG-DC tra le due varietà

Le repliche, 65 in totale e con durata pari a 8 ore ciascuna, sono state effettuate utilizzando 31 individui adulti di S. pyri per Conference e di 34 per William. Il numero di insetti testati per ogni genotipo di pero supera abbondantemente il valore medio dei lavori presenti in letteratura scientifica. Sono stati esaminati, per ogni genotipo, i parametri non sequenziali (cap. 3.3.2) riguardanti l‟onda 1 e l‟onda 2 ovvero per ogni onda si sono calcolate la durata totale e la

frequenza di comparsa (valori) e indicati come: durata 1; durata 2; frequenza 1; frequenza 2. Ho

poi calcolato la sommatoria della durata totale di tutte le onde ovvero dell‟onda 1 più l‟onda 2 ed indicata come: durata 1 + 2. Come per l‟onda 1 e l‟onda 2 ho calcolato la durata totale e la

frequenza di comparsa relative ai periodi di digiuno ed indicati come: no-probing (np). Come nei

casi precedenti i valori sono espressi in valore medio tra gli individui (i valori della frequenza di comparsa ai periodi di no-probing o np rientrano tra i pre-penetration parameter, cap. 3.3.2)

Tra i parametri non sequenziali per l‟onda 1, l‟onda 2 e per i periodi di np (pre-penetration

parameter) ho poi calcolato la loro durata media (durata totale/frequenza; anche in questo caso con

valori espressi come valore medio tra gli individui) ed indicati come: frequenza media 1; frequenza media 2; frequenza media np.

Infine, tra i parametri sequenziali (cap. 3.3.2) ho calcolato la durata del primo periodo di non-alimentazione (duration of 1st no-penetration o no-probe), la durata della prima penetrazione (duration of 1st penetration o 1st probe) e la durata del secondo periodo di non-alimentazione (duration of 2nd np) rispettivamente indicati come: periodo 1 np; durata 1 probe e durata 2 np.

Dal confronto tra le due varietà (tab 1; graf. 1) è emersa tra i parametri analizzati una differenza significativa con valore di p = 0,014 (p<0,05) della durata totale dell‟onda 2 in favore della varietà William con un di tempo medio pari a 1906,65 rispetto ai 1275,73 secondi della varietà Conference e con un errore standard rispettivamente di 82,90 per William e 241,66 per Conference.

Gli altri parametri non hanno evidenziato differenze statisticamente significative. Dall‟osservazione della tabella 1 si osservano alcuni parametri che dal confronto tra le due varietà hanno evidenziato valori di p relativamente contenuti (p<1). In particolare questo aspetto riguarda la durata media dell‟onda 1, la frequenza di comparsa degli np e la frequenza di comparsa dell‟onda 1. Dei tre parametri quello che evidenzia un valore maggiore in favore di Conference rispetto a William è quello relativo alla durata media dell’onda 1 rispettivamente con 328,82 sec contro i 280,33 sec (p=0,09) con errore standard di 21 e 17,84. La frequenza di comparsa degli np ha segnato per William valori di 22,75 rispetto ai 17,18 della Conference (p=0,09) con errore standard rispettivamente di 2,44 e 1,92 mentre la frequenza di comparsa dell‟onda 1 ha segnato

32,13 per William contro i 25,24 di Conference (p=0,09) con errore standard rispettivamente di 3,15 e 2,6.

Conference William

Media Er st Media Err St P level

Durata np 18495,72 1107,45 17277,11 1123,73 0,49 Durata 1 8846,97 1045,12 9291,88 1057,59 0,8 Durata 2 1275,73 82,90 1906,65 241,66 0,014 Durata 1+2 10122,71 1080,46 11198,53 1134,09 0,51 Frequenza np 17,18 1,92 22,75 2,44 0,09 Frequenza 1 25,24 2,60 32,13 3,15 0,09 Frequenza 2 9,06 0,83 10,09 1,10 0,66 Durata media np 2316,50 439,32 1965,00 575,44 0,17 Durata media 1 328,82 21,00 280,33 17,84 0,09 Durata media 2 188,65 25,76 249,10 42,07 0,1 Durata 1 np 3893,38 799,00 2625,41 591,50 0,25 Durata 1 probe 1046,81 101,10 994,60 126,91 0,53 Durata 2 np 2187,30 738,12 2560,00 979,88 0,97

Tab. 1: i parametri osservati con l‟EPG-DC per le varietà William e Conference messi a confronto. In giallo la durata complessiva dell‟onda 2 che differisce in maniera significativa tra le due varietà. I valori dei parametri analizzati sono espressi in secondi. 0,00 500,00 1000,00 1500,00 2000,00 2500,00 1 Cultivar Te m po ( s e c ) Durata 2 C Durata 2 W

4.3 Influenza di Conference e William sul comportamento di S. pyri nella fase di pre- feeding e sulla permanenza dell’insetto sull’ospite.