CAPITOLO 5: Materiali e metodi
5.5 Terzo metodo: co-trasfezione dei vettori pCW-Cas9 e pLX-sgRNA e HR410PA-
5.5.1 Costruzione del vettore pCW-Cas9
sotto il promotore doxy
puromicina e il gene che conferisce resistenza all’antibiotico ampicillina, utili entrambi nella selezione delle colonie positive, quindi aventi il vettore.
. Esempi di analisi del FACS per le due linee cellulari trattate
Terzo metodo: co-trasfezione dei vettori pCW-Cas9
1/ssODN
La terza e ultima tecnica descritta in questa tesi si propone di utilizzare un sistema lentivirale per effettuare il meccanismo di trasduzione nelle cellule target. In collaborazione con il CNR di Pisa è stato ottenuto un lentivirus che presenta il vettore
(contenente il gene Cas9) che verrà inserito nelle linee cellulari di interesse
pLX-sgRNA (contenente il filamento RNA guida) ed il
-5.4.2 HR410PA-1, che introdurrà la sequenza del gene con allele protettivo “A”. Inoltre, in sostituzione del vettore HR410PA
utilizzato il singolo filamento ssODN, che in ugual modo al vettore donor introduce la
.1 Costruzione del vettore pCW-Cas9
è composto da 11885 bp e permette l’espressione del gene sotto il promotore doxyciclina inducibile. Presenta il marcatore di selezione della puromicina e il gene che conferisce resistenza all’antibiotico ampicillina, utili entrambi
colonie positive, quindi aventi il vettore.
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. Esempi di analisi del FACS per le due linee cellulari trattate
e pLX-sgRNA e
La terza e ultima tecnica descritta in questa tesi si propone di utilizzare un sistema lentivirale per effettuare il meccanismo di trasduzione nelle cellule target. In collaborazione con il CNR di Pisa è stato ottenuto un lentivirus che presenta il vettore ) che verrà inserito nelle linee cellulari di interesse (contenente il filamento RNA guida) ed il plasmide , che introdurrà la sequenza del gene LGALS3 Inoltre, in sostituzione del vettore HR410PA-1 viene utilizzato il singolo filamento ssODN, che in ugual modo al vettore donor introduce la
bp e permette l’espressione del gene Cas9 ciclina inducibile. Presenta il marcatore di selezione della puromicina e il gene che conferisce resistenza all’antibiotico ampicillina, utili entrambi
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Figura 32. Il vettore pCW-Cas9. Tratto dal sito Addgene.
Per la costruzione del vettore pCW-Cas9 sono state utilizzate delle cellule packaging HEK 293T, capaci di far aumentare l’espressione delle proteine virali poiché contengono l’antigene T dei virus SV40, che permette la replicazione di plasmidi trasfettati contenenti l’origine di replicazione SV40.
In base a ciò, sono state seminate tre milioni di cellule HEK in piastre p100 con il proprio terreno DMEM high glucose completo e dopo 24 ore dalla semina vengono trasfettate con l’agente trasfettate polietilenimmina (PEI) e i tre plasmidi. La soluzione utilizzata è infatti così composta:
• 12µg di plasmide di nostro interesse
• 8µg di plasmide psPAX2
• 4µg di plasmide pMD2.G
• 1ml di terreno contenente il 2% di FBS
• 45µl di PEI 20µM
N.B.: i plasmidi psPAX2 e pMD2.G contengono i geni del capside del virus.
La soluzione viene vortexata per 10 secondi e lasciata successivamente incubare per 15minuti a temperatura ambiente. In seguito viene vortexata nuovamente.
Rimuovere delicatamente il terreno dalle piastre contenenti le cellule HEK 293T. Aggiungere 5 ml di terreno con il 2% di FBS privo di antibiotici pen/strept.
Si aggiunge la mix di trasfezione precedentemente composta con attenzione, goccia a goccia con il puntale molto vicino alla superficie del liquido.
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Dopo 6 ore di trasfezione si effettua un nuovo cambio terreno aggiungendo 10ml di terreno completo. A 48 ore dalla trasfezione si raccoglie il mezzo contenente il virus e si sostituisce con un nuovo mezzo completo. A 72 ore dalla trasfezione si raccoglie nuovamente il mezzo e si unisce a quello raccolto a 48 ore, procedendo con il protocollo che permette di ottenere il lentivirus completo con il reagente specifico “Lenti-X Concentrator” (ditta Clontech).
-Lenti-X™ ConcentratorProtocol-at-a-Glance
Per avere il virus completo, una volta averlo trasfettato nella piastra contenente le cellule HEK 293T, si esegue il protocollo riportato qui di seguito:
• Centrifugare il contenuto della piastra a 500 x g per 10 minuti ad una temperatura pari a 4°C
• Il sovranatante contenente il virus viene filtrato con un filtro di 0.45 µm (non usare il filtro 0.22 µm che tratterrebbe i virus)
• Successivamente viene aggiunto il Buffer Lenti-X Concentrator con un rapporto 1V di buffer :3V di filtrato (40ml di filtrato e 13ml di buffer)
• Incubare a 4 °C per 3-4 ore
• Dopo le 4 ore si effettua una centrifuga 1500 x g per 45 minuti a 4°C. Dopo la centrifuga è visibile il pelle, il quale, dopo aver rimosso il terreno, viene risospeso in 1/10 o 1/100 di PBS (in questo caso 300 µl di PBS)
• Conservare il virus a -80°C -Valutazione del titolo virale
Prima di trasfettare le cellule è stato identificato il giusto titolo virale che permetteva una resa di trasfezione elevata e quindi un maggior numero di unità formanti colonie. Sono state, infatti, seminate 10000 cellule HEK 293T in pozzetti di piastre p24-well e successivamente infettate da diverse concentrazioni di lentivirus: lentivirus diluito in PBS 1:10, lentivirus diluito in PBS 1:100 e lentivirus non diluito. In ogni pozzetto vengono aggiunti 5 µl di Polibrene 0.8 mg/ml in modo da ottenere 4µg/ml di concentrazione finale in ogni pozzetto. Il Polibrene è un polimero cationico utile nell’incrementare l’efficienza di trasduzione di virus a livello della membrana delle cellule target.
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Controllo(no virus) Controllo(no virus) 1µl del dil 1:100 2µl del dil 1:100 5µl del dil 1:100 1µl del dil 1:10 2µl del dil 1:10 5µl del dil 1:10 1µl non diluito 2µl non diluito 10µl non diluitoTabella 22. Titolazione del lentivirus
Il giorno successivo all’ infezione, viene fatto il trattamento con 0.5 µl di puromicina 2mg/ml nel controllo per individuare l’assenza di geni che conferiscono resistenza alla puromicina e quindi la morte di tutte le cellule.
Infatti dopo 48ore dal trattamento, si è identificata la completa morte delle cellule nel pozzetto di controllo permettendo così il passaggio successivo: la colorazione.
Il protocollo per la colorazione è quello che segue:
• Si aspira il mezzo e si effettua il lavaggio con 1 ml di PBS e dopo di ché si rimuove
• Si aggiunge 250 µl paraformaldeide sotto cappa e si lascia incubare su superficie piana a temperatura ambiente per 10 minuti
• Si rimuove il paraformaldeide e si lava in 0.5 ml di PBS
• Si rimuove il tutto e si aggiunge 200 µl di Cristal violetto
• Si lascia a temperatura ambiente per 15 minuti su un basculante
• Si rimuove tutto e si lava abbondantemente ma in modo delicato con acqua distillata
• Si lascia asciugare overnight a temperatura ambiente Il protocollo di decolorazione :
• Aggiungere 500 µl di acido acetico al 10%
• Incubare a temperatura ambiente su basculante per 10-15 minuti
• Prelevare 150 µl da ciascun pozzetto e trasferirli in una piastra a 96 pozzetti per la lettura allo spettrofotometro
Si rielaborano i dati per creare la retta di taratura.
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