Capitolo 3: RISULTAT
3.10 Costruzione di un vettore per l’ espressione regolabile della DNA topoisomerasi
3.10.3 Costruzione del vettore di espressione pFFHA T-Rex-DEST30 Top1 SiRNAr
Per clonare nel vettore di espressione pFFHA T-Rex-DEST30 il gene TOP1 SiRNAr, presente nel plasmide pEZ2T TOP1 SiRNAr ottenuto (paragrafo precedente), si è dovuto passare attraverso la costruzione del vettore intermedio ‘di entrata’ pENTR TOP1 SiRNAr. Tale passaggio è stato realizzato utilizzando la reazione BP del kit GATEWAY (vedi MATERIALI E METODI), in cui avviene la ricombinazione tra i siti attB fiancheggianti la sequenza del gene di interesse e i siti attP presenti sul pDONR. Il gene TOP1 SiRNAr fiancheggiato dalle sequenze di riconoscimento da parte della BP clonasi (attB1 e attB2) è stato ottenuto con una reazione di PCR (Fig. 47). In questa reazione il primer forward (AttB1) era un oligonucleotide di 55 bp, recante al terminale 5’ la sequenza attB1 (29 bp), mentre al 3’ era presente la sequenza iniziale della topoisomerasi (25 bp) con l’ATG. Il primer riverse (AttB2) era, invece, di 58 bp e presentava all’estremità 5’ la sequenza AttB2 (29 bp), mentre al 3’ la sequenza terminale di Top1 e due codoni di terminazione TAG. Il DNA stampo nella reazione era il plasmide pEZ2T TOP1 SiRNAr; l’enzima usato, Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity INVITROGEN; il termociclo, attB (vedi MATERIALI E METODI).
Figura 47. Prodotto della PCR effettuata con la coppia di primer attB1 e attB2.
L’amplificato ottenuto è stato purificato dai primer per elettroforesi ed eluizione da gel. Successivamente, è stata assemblata la reazione che prevede l’utilizzo della BP clonasi, del pDONR221 e del prodotto di PCR da clonare. Il sistema sfrutta la strategia di ricombinazione tipica del fago lambda, in cui le ricombinasi specifiche guidano la ricombinazione tra le regioni comprese tra i siti AttB1 e AttB2, presenti nel DNA amplificato con la PCR, e le zone comprese tra i siti AttP1 e AttP2 , presenti nel pDONR221.
Il prodotto della reazione di ricombinazione (1/16 del volume) è stato utilizzato per trasformare cellule E.coli DH5α elettrocompetenti. La selezione dei trasformanti era duplice: le cellule che ricevevano il plasmide che non aveva ricombinato morivano, perché tra i siti attP del pDONR221 è presente il gene ccdB, codificante per una tossina; d’altra parte, solo le cellule col plasmide ricombinante potevano sopravvivere, perché questo fornisce la resistenza alla kanamicina. Dalla piastra dei trasformanti sono stati prelevati 10 cloni, dai quali è stato estratto il DNA plasmidico, successivamente analizzato per elettroforesi. Sono stati scelti 2 cloni, il 5 e il 6, sulla base dell’osservazione che in essi era assente DNA plasmidico non ricombinante, e questi sono stati ulteriormente processati per digestione enzimatica multipla. Per una digestione sono stati usati gli enzimi Nde I+Eco RV, mentre per un’altra Xho I+Hind III+BstXI. Se i plasmidi fossero stati quelli desiderati, la prima digestione avrebbe dovuto produrre due frammenti di 3122 bp e 1722 bp; la seconda, invece, tre frammenti di 2989 bp, 1034 bp e 821 bp, rispettivamente. I risultati della delle digestioni enzimatiche suggerivano che i plasmidi potessero essere quelli desiderati (Fig. 48).
A questo punto, abbiamo deciso di procedere al sequenziamento dell’intero inserto in entrambi i cloni utilizzando i primer M13, Toposeq2b, Toposeq3b, Sere44 (vedi MATERIALI E METODI). Dalle analisi delle sequenze risultava che entrambi i cloni, pENTR TOP1 SiRNAr 5 e 6, avevano conservato la sequenza corretta di Top1 e le mutazioni precedentemente introdotte nella regione bersaglio dell’RNA interference (risultato non mostrato).
Figura 48. Prodotti delle digestioni enzimatiche dei cloni pENTR TOP1 SiRNAr 5 (corsie 1, 3, 5) e 6 (corsie 2, 4, 6). Corsie 1 e 2: digetstione con Nde I+Eco RV; corsie 3 e 4: digetstione con Xho I+Hind III+BstX; corsie 5 e 6: plasmidi non digeriti.
Pertanto, sia l’uno che l’altro sono stati usati per la seconda reazione di clonaggio che sfrutta la tecnologia GATEWAY: il trasferimento del gene nel vettore di espressione pFFHA T-Rex-DEST30.
Questo passaggio avviene mediante la reazione detta LR, in quanto sfrutta l’enzima LR clonasi, che riconosce le sequenze di ricombinazione attL (presenti nei vettori di entrata pENTR TOP1 SiRNAr 5 e 6) e attR (presenti nel vettore di espressione pFFHA T-Rex- DEST30). I prodotti ottenuti sono stati, quindi, usati per trasformare cellule E.coli DH5α elettrocompetenti, successivamente selezionate, come nel caso della reazione BP, sulla base del gene ccdB e di un antibiotico selettivo (ampicillina, in questa circostanza). Da due cloni derivanti dalla reazione con pENTR TOP1 SiRNAr 6 (6_5 e 6_6) e uno derivante dalla reazione con pENTR TOP1 SiRNAr 5 (5_5) sono stati estratti i plasmidi pFFHA T-Rex-DEST30 Top1SiRNAr 5_5, 6_5 e 6_6 e, successivamente, analizzati per digestione con gli enzimi di restrizione. Nelle analisi sono stati usati gli enzimi: HindIII+XhoI e NdeI+EcoRV. I frammenti attesi erano: nella prima digestione di 4246
bp, 1677 bp, 1034 bp, 904 bp e 454 bp; nella seconda, invece, di 5064 bp, 1896 bp, 732 bp e 623 bp. I prodotti delle digestioni enzimatiche (Fig. 49) suggerivano che tutti e tre i vettori di espressione contenessero l’inserto desiderato, le cui sequenze erano state controllate nei passaggi precedenti. Del clone pFFHA T-Rex-DEST30 Top1SiRNAr 6_5 è stata sequenziata anche la regione compresa tra l’epitopo HA e l’inizio della sequenza di Top1, utilizzando il primer pDest seq, per verificare che negli eventi di ricombinazione non si fossero generati dei codoni di terminazione o, comunque, delle mutazioni. L’ analisi ha dato risultati positivi: il clone pFFHA T-Rex-DEST30 Top1SiRNAr 6_5 codifica per l’intera proteina di fusione HA-Top1; pertanto, esso potrà essere usato per la co-trasformazione, insieme al plasmide pcDNA 6TR, che codifica per il repressore Tet, delle cellule HCT116, al fine di ottenere una linea cellulare che esprime livelli regolabili dell’enzima DNA topoisomerasi I fusa all’epitopo HA.
Figura 49. Prodotti delle digestioni enzimatiche dei cloni pFFHA T- Rex-DEST30 Top1SiRNAr 5_5 (corsie 1, 5, 9), 6_5 (corsie 2, 6, 10), 6_6 (corsie 3, 7, 11) e del vettore pFFHA T-Rex-DEST30 (corsie 4, 8, 12). Corsie 1 -4: digetstione con Hind IIi I+Xho I; corsie 5-8: digetstione con Nde I+Eco RV; corsie 9-12: plasmidi non digeriti.