Crassostrea gigas

Gli esemplari adulti di Crassostrea gigas (n=12, 8.30 ± 0.45 cm, 8.70 ± 1.2 g) utilizzati durante l’esperimento sono stati prelevati dall’impianto di mitilicoltura di La Spezia in data 15/03/2017; dopo un periodo di acclimatazione alle condizioni di laboratorio di 48 ore, sono state esposte alle microsfere di alginato preparate con il metodo precedentemente descritto. Le condizioni sperimentali sono state mantenute costanti per tutta la durata del test: bagno termostatato e refrigerato (Intermed Heto, CB60) temperatura di 25°C e salinità 31 PSU, areazione ed illuminazione artificiali (2000 lux). Le ostriche sono state esposte singolarmente in un beaker avente un volume di 400 ml.

Figura 62 Bagno termostatato Intermed Heto CB60 durante l'esposizione.

Le modalità della sperimentazione hanno riguardato l’impiego di sole microsfere di alginato con microplastiche e di microsfere di alginato con microplastiche in presenza di microalghe libere nel

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mezzo (Fig.62); ogni condizione è stata testata in triplicato ed il materiale fecale prodotto da ogni singolo organismo è stato raccolto, nei test preliminari, dopo 2,5 e 20h di esposizione. Sono

state testate concentrazioni scalari di microplastiche

immobilizzate (125 MP/l, 200 MP/l e 250 MP/l).

Figura 63 Condizione ad inizio test, in alto le ostriche alimentate con microsfere e microalghe, in basso solo con microsfere di alginato.

Dalla raccolta del materiale fecale sono state escluse, quando presenti, le pseudofeci, in quanto non legate al processo digestivo di Crassostrea gigas (Fig.64).

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Fig. 64 - Materiale fecale raccolto a 20h e successivamente analizzato.

A seguito dei risultati preliminari, la durata del test è stata prolungata fino a 72 ore, con due esposizioni consecutive a t0 ed a 48 ore. La seconda esposizione è stata effettuata cambiando la soluzione e mantenendo le stesse condizioni ambientali; durante questa operazione le ostriche sono state sciacquate con acqua distillata al fine di evitare errori nel conteggio dovuti alla presenza, nel beaker, del materiale egesto dagli organismi durante la prima esposizione.

Nel corso della sperimentazione si è provveduto a mantenere le ostriche in un ambiente più stabile possibile evitando movimenti di persone all’interno del laboratorio.

7.2.3 Acetilcolinesterasi

Le colinesterasi sono un gruppo di enzimi altamente polimorfici presenti in diverse specie del regno animale, idrolizzano una

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grande varietà di substrati, utilizzando un attacco nucleofilico, che genera un intermediario in forma di acil- o fosforil-enzima e la sua seguente deacilazione o defosforilazione; sono presenti nella

fessura sinaptica dove catalizzano l’idrolisi del

neurotrasmettitore, l’acetilcolina, ma anche in altre regioni dell’organismo (Massoulié et al., 1993).

L’inibizione della colinesterasi è uno dei principali marker di esposizione utilizzati nel monitoraggio biologico e, relativamente all’ambiente marino, ha trovato applicazione su un gran numero di organismi appartenenti a differenti taxa (Huggett et al., 1992; Fossi and Leonzio, 1994; Fossi, 1994; Goksøyr et al., 1992; Walker et al., 1996; Walker, 1998; Fossi et al., 2001; Agrone et al., 2011; 2012); inoltre, è stato particolarmente impiegato su mitilo ed ostrica, principalmente a causa della loro propensione al bioaccumulo di contaminanti durante l’alimentazione (Galgani & Bocquen, 1990).

Nelle branchie di Crassostrea gigas sono state individuate due possibili forme (A e B) di acetilcolinesterasi, una sensibile ed una resistente, con inibizione bifasica. Tali forme hanno mostrato differente peso molecolare (200 e 330 kDa), tipo di glicosilazione, idrofobicità e generale sensiblità agli inibitori. La distribuzione generica di queste due forme è illustrata in tabella 29.

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Tabella 29 L’attività è espressa in nmol di AcSCh Idrolizzato/min/mg di proteine totali (Bocquené et al., 1997)

Tessuto AChE totale A/B ratio

Branchie 28.1±2.8 4.7 Epatopancreas 25.5±3.6 2.8 Mantello 24.3±2.5 0.2 Palpi Labriali 13.0±1.1 0.2 Muscolo striato 6.9±0.7 2.0 Muscolo liscio 6.2±0.2 1.3

Il possibile effetto di inibizione dell’acetilcolinesterasi derivante dall’ingestione di microplastiche è ancora oggetto di studio, ma un esperimento condotto su Pomatoschistus microps (Gobiidae) ha permesso di identificare un effetto di inibizione dell’AChE dato dal solo materiale plastico e sinergico con il pirene, idrocarburo policiclico aromatico (IPA). L’inibizione provocata dalle microplastiche dipende inoltre da un meccanismo differente da quello del contaminante testato in contemporanea, fattore che rende il possibile effetto combinato di queste due sostanze di estrema pericolosità per gli organismi marini (Oliveira et al., 2013).

L’effetto delle microplastiche inglobate in matrice organica è stata valutata in termini di inibizione dell’acetilcolinesterasi negli organi coinvolti nel processo di selezione ed ingestione, ossia branchie, mantello ed apparato digerente.

Dopo l’esposizione alle microplastiche, le ostriche sono state sezionate in diverse parti ognuna delle quali è stata analizzata per la valutazione del contenuto proteico totale.

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A tal fine, i campioni sono stati omogenati in Potter di vetro con pestello in teflon e lavati in Triton X-100, la quantificazione del

contenuto proteico è stata effettuata con metodo

spettrofotometrico (Bio-Rad/Sigma Aldrich).

La valutazione dell’attività di AChE è stata effettuata tramite metodo colorimetrico (Ellman et al., 1961), utilizzando Acetil-β- metil tiocolina ioduro (AcTChI) come substrato e Ditio-bis- nitrobenzonato (DTNB) come reagente. Questo metodo si basa sull’aumento della colorazione gialla prodotta dalla reazione tra tiocolna e DTNB, formate l’anione acido tio-nitrobenzoico (TNB). Il prodotto della reazione assume una colorazione gialla che va letta, allo spettrofotometro, alla lunghezza d’onda di 412nm. Per l’esecuzione del test sono state preparate le soluzioni riportate in tabella 30.

Tabella 30 Soluzioni preparate per i dosaggi.

Tampone Na-fosfato 0.1M pH 7 39 ml di soluzione A + 61 ml di soluzione B e portare a 200 ml con acqua distillata.

• Soluzione A = soluzione 0.2 M di sodio fosfato monobasico (NaH2PO4)

• Soluzione B = soluzione 0.2 M di sodio fosfato bibasico (Na2HPO4)

Tampone Na-fosfato 0.1M pH 8 5.3 ml di soluzione A + 94.7 ml di soluzione B e portare a 200 ml con acqua distillata.

• Soluzione A = soluzione 0.2 M di sodio fosfato monobasico (NaH2PO4)

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Soluzione B = soluzione 0.2 M di sodio fosfato bibasico (Na2HPO4)

DTNB • 8 mg di DTNB in polvere

• 3 mg di sodio bicarbonato

• Portare a 72 ml con tampone fosfato 0.1 M pH7.

AcTChI • 20 mg di AcTChI in polvere

• Portare a 1 ml con tampone fosfato 0.1 M pH 7

Le letture allo spettrofotometro, una volta inserito il campione ed aggiunti 100 µl di acetiltiocolina, procedono ogni minuto per 10 minuti. È previsto l’impiego di due soluzioni di Bianco, preparate come segue:

Tabella 31 Preparati per i dosaggi.