Danielsson et al 2013

Nel 2013 è stato inoltre pubblicato il lavoro di Danielsson et al. [28] incentra- to sui canali ionici responsabili delle correnti IKre IKsnell’uomo, topo e coniglio.

Nel caso umano, gli esperimenti sono stati condotti su campioni di tessuto cardia- co a diversi stadi embrio-fetali (settimane gestazionali 4.5-10), ottenuto in seguito ad aborto del primo trimestre tramite la tecnica dell’aspirazione a vuoto. Soltanto le cellule spontaneamente battenti sono state selezionate per le misurazioni e in figura 2.17 sono mostrati due esempi di potenziale d’azione registrati.

I cardiomiociti embrionali umani hanno mostrato un certo grado di variabilità nella morfologia e nei parametri del potenziale d’azione, in particolare MDP, APD

Figura 2.17: Figura adattata da Danielsson et al. [28]: potenziali d’azione spontanei di cellule embrionali umane.

e frequenza ([28], figura S1 del materiale supplementare): il valore di MDP varia tra -65 e -40 mV e l’OS è compreso tra +25 e +40 mV; la durata dell’AP rientra nel range 100-250 ms, mentre la frequenza è molto variabile tra 1 e 2.5 Hz. I risultati degli esperimenti di voltage-clamp per determinare la dipendenza dal voltaggio nell’attivazione delle correnti IKr e IKs umane sono presentati in figura

2.18 e confrontate con i casi di topo e coniglio.

Figura 2.18: Figura adattata da Danielsson et al. [28]: dipendenza dal voltaggio

dell’attivazione di IKre IKsin cellule embrionali di uomo, topo e coniglio.

Per esplorare ulteriormente il ruolo dei canali di IKr, Danielsson et al. hanno con-

2.3 Elettrofisiologia 53

La figura 2.19 mostra l’effetto di 1 µM E-4031: le due cellule GW5 non hanno mostrato alcun prolungamento dell’APD, al contrario della cellula GW7-7.5. La seconda cellula GW5 (pannello intermedio) e la cellula GW7-7.5 hanno mostra- to una diminuzione della frequenza e la cellula GW7-7.5 ha inoltre mostrato un innalzamento dell’MDP. Le variazioni medie dei parametri dell’AP (estratte dalle figure 5C-F in Danielsson et al. [28]) sono riassunte di seguito: l’MDP si depola- rizza di 6 mV e il picco dell’AP si abbassa di circa 4 mV; la durata del potenziale d’azione (APD50) non varia significativamente, mentre il cycle-length aumenta

del 35%.

Figura 2.19: Figura adattata da Danielsson et al. [28]: effetto di 1 µM E-4031 su AP spontanei di cellule embrionali umane.

Capitolo 3

Mutazioni geniche dei canali ionici

Introduzione

Il nodo senoatriale è una struttura anatomicamente ed elettrofisiologicamente eterogenea, che esprime un set unico di canali ionici necessario per la generazione e la propagazione del potenziale d’azione. Una funzionalità alterata del SAN può essere provocata dalla disfunzione dei canali ionici in seguito a rimodellamento in condizioni patologiche, o come risultato di mutazioni geniche [82] ereditarie o mutazioni "de novo" (i genetisti chiamano mutazione "de novo" la mutazione diagnosticata in un individuo, che non risulta essere presente nel corredo genetico dei genitori: significa che non è stata ereditata, ma è frutto di un evento "nuovo", verificatosi per la prima volta in quel soggetto).

In questo capitolo verranno introdotte alcune nozioni di base sulle mutazioni ge- niche e sulle linee cellulari di coltura utilizzate nei laboratori di elettrofisiologia per studiare le caratteristiche dei canali ionici mutati. Successivamente verran- no presentate ed approfondite le principali mutazioni alla base delle più comuni sindromi aritmiche riscontrate nell’uomo.

3.1

Mutazione genica

Per mutazione genica si intente un cambiamento della sequenza nucleotidi- ca del DNA di un organismo che interessa singoli geni (al contrario delle mu- tazioni cromosomiche che coinvolgono ampi tratti di cromosomi o anche cro- mosomi interi e, di conseguenza, molti geni). Il cambiamento può riguardare una o poche basi azotate: nel primo caso si parla più propriamente di mutazioni puntiformi. Esse si possono verificare per sostituzione di una base o inserzio- ne/duplicazione/delezione (frameshift).

Le sostituzioni di base si suddividono in:

• transizioni - sostituzione di una purina (A, G) con un’altra purina, o di una pirimidina (T, C) con un’altra pirimidina. È mantenuto l’orientamento purina-pirimidina nelle due eliche del DNA;

• transversioni - sostituzione di una purina con una pirimidina o viceversa. L’orientamento delle purine e pirimidine nelle due eliche è invertito.

La mutazione frameshift è dovuta a inserzione (aggiunta) o delezione (sottrazio- ne) di una coppia di basi azotate in regioni codificanti o non [70]. Mentre nel caso della sostituzione di una base viene alterato uno solo dei codoni (triplette specifi- che di tre nucleotidi), in questo caso le sequenze dei nucleotidi vengono ad avere una base in più (inserzione) o una base in meno (delezione) e le conseguenze sono in genere più gravi: a partire dal punto in cui si è verificata la mutazione, infati, tutto il messaggio risulta alterato a causa dello sfasamento e dello slittamento del- la sequenza di lettura (figura 3.1 A). Se la base o sequenza inserita è identica a quella precedente si parla di duplicazione. Quando una mutazione per sostituzio- ne di base cade nella regione codificante di un gene e modifica la sequenza di un codone, essa può generare tre situazioni con diversi effetti fenotipici [70]:

3.1 Mutazione genica 57

Figura 3.1: Esempi di mutazioni frameshift (A), missenso (B), non-senso (C) e silente (D).

• mutazione missenso - nella proteina codificata dal gene mutato si determina la sostituzione di un amminoacido con uno errato e ciò può modificare l’at- tività della proteina stessa (rendendola difettosa), con un effetto fenotipico da lieve a grave, a seconda dell’entità del cambiamento (figura 3.1 B);

• mutazione non-senso - la sintesi della proteina codificata subisce una termi- nazione anticipata per via del fatto che la tripletta modificata non codifica per alcun amminoacido e viene interpretata come codone di arresto della sintesi, per cui si ha la produzione di proteine tronche e, nella maggior parte dei casi, caratterizzate da totale perdita di funzione (figura 3.1 C);

• mutazione silente - nella proteina codificata dal gene non si osserva alcuna differenza rispetto a quella wild-type (forma originale), non viene modi- ficata la sequenza aminoacidica, perché la nuova tripletta codifica per lo stesso aminoacido (se, per esempio, la mutazione riguarda una base nel- la terza posizione del codone, spesso l’aminoacido non cambia). Questo

è reso possibile grazie alla caratteristica di ridondanza dell’informazione genetica, perciò non si osserva alcun effetto fenotipico (figura 3.1 D). Al contrario, le inserzioni, duplicazioni o delezioni portano quasi sempre ad un fenotipo mutante completo perché sono responsabili della sintesi di proteine gra- vemente alterate.

Il cambiamento fenotipico che una mutazione può determinare è, essenzialmente, di due tipi:

• loss of function, mutazione con perdita di funzione - il prodotto che ne deriva ha una funzione ridotta o assente;

• gain of function, mutazione con guadagno di funzione - il prodotto che ne deriva acquisisce una nuova funzione, anomala o potenziata.

Poiché gli organismi diploidi conservano due copie di ciascun gene, essi possono portare alleli identici, cioè essere omozigoti per un gene, oppure trasportare alleli diversi, cioè essere eterozigoti per un gene. Un allele mutante recessivo è definito come quello in cui entrambi gli alleli devono essere mutanti per far in modo che venga osservato il fenotipo mutante, ovvero l’individuo deve essere omozigote per l’allele mutante per mostrare il fenotipo mutante. Al contrario, le conseguenze fe- notipiche di un allele mutante dominante si osservano in un individuo eterozigote, ovvero che porta un allele mutante e uno wild-type [70]. Anche se sono stati de- scritti casi in cui mutazioni loss of function sono dominanti o mutazioni gain of function sono recessive, nella stragrande maggioranza dei casi, le mutazioni re- cessive sono con perdita di funzione e le mutazioni dominanti sono con guadagno di funzione [9].

Infine una mutazione è detta neutra quando non ha effetto sul fenotipo e passa "inosservata". Si verifica quando: