Determinazione dell’attività della MPO

Si determina l'attività della MPO come misura indiretta dell'infiltrazione leucocitaria al ventottesimo giorno dall'inizio dell'esperimento. L'inibizione dei prodotti

Mpo è un enzima prodotto principalmente dai leucociti polimorfonucleati ed è associato con il grado di infiltrazione neitrofilica nei tessuti. Dopo 28 giorni di trattamento con DSS il livello dell'attività di MPO è aumentato nel gruppo colitico di tre volte rispetto al non colitico. Mentre nei gruppi gruppi colitici trattati con Sulfasalazina e cacao è di solo 2 volte, indicando un'inibizione del 31% e 34% rispettivamente. Dato che l'attività dell'MPO è considerato un marcatore biochimico dell'infiltrazione neutrofilica, questo risultato suggerisce che l'estratto del cacao arrichito di polifenoli eserciti effetti antiinfiammatori riducendo l'infiltrazione neutrofilica nella mucosa del colon.

4.2.2 Western Blotting

Si esaminano gli effetti della Sulfasalazina e dell'estratto del Cacao arricchito in polifenoli sull'espressioni di iNOS e COX-2 nei colon, in quanto iNOS e COX-2 sono responsabili dell'induzione di NO e PGE2 rispettivamente. INOS risultò inibito dalla Sulfasalazina del 6% mentre dall'estratto di Cacao arricchito in polifenoli del 41%.

Campioni Non Col Colitico Colitico Col + Cac Col + Sul

iNOS

β-Actina

% I --- --- --- 41% 6%

Figura 3. Immagine di Western Blot dell'inibizione dei prodotti sull'espressione di iNOS il giorno ventottesimo dall'inizio dell'esperimento

Campioni Non Col Colitico Colitico Col + Cac Col + Sul COX-2 β-Actina % I --- --- --- 23% 30%

Figura 4. Immagine di Western Blot dell'inibizione dei prodotti sull'espressione di COX-2 il giorno ventottesimo dall'inizio dell'esperimento

QUINTO CAPITOLO

5. Discussione

L'uso di prodotti naturali antiinfiammatori fornisce una attrattiva alternativa per controllare alcune malattie che hanno a che vedere con l'infiammazione, soprattutto in pazienti che non rispondono o che svilupano effetti collaterali con le terapia convenzionale. I polifenoli, metaboliti secondari di origine vegetale, costituiscono uno dei gruppi maggioritari e più diffusi in natura, presenti nella dieta. Negli esseri umani l'assunzione giornaliera di polifenoli è maggiore di 1g/dia.

Shapiro et Al., ha suggerito che una dieta ricca in polifenoli può esser utilizzata como terapia di supporto nei pazienti con IBD. Inoltre, vari saggi clinici hanno dimostrato la relazione tra l'assunzione giornaliera di polifenoli (in particolare flavonoidi) e la riduzione di incidenza di cancro al colon e di malattie cardiovascolari e neurovegetative.(Stevenson, D. E.; Hurst, R. D. Polyphenolic phytochemicals just antioxidants or much more? Cell. Mol. Life Sci. 2007, 64, 2900–2916.)

In questo lavoro si è studiato per la prima volta l'effetto antiinfiammatorio di un estratto del cacao (via orale, 500 mg/kg) arricchito in polifenoli in un modello sperimentale di colite ulcerosa cronica in topi Balb c. Per questo si è messo a punto un protocollo sperimantale basato nella somministrazione orale nella bevanda di DSS durante 28 giorni.

La colite indotta da DSS nei topi presenta caratteristiche cliniche e istologiche infiammatorie simili a quelle osservate negli esseri umani. Questo modello ha come vantaggio la facile somministrazione dei prodotti (proinfiammatori e antiinfiammatori), dissoluti nella bevanda acquosa, una bassa mortalità e un quadro patologico definito. Questo modello è infatti ampiamente utilizzato per la valutazione di strategie terapeutiche nell'IBD. La somministrazione continuativa di DSS induce una colite

ulcerosa con cambiamenti morfologici simili a quelli osservati nel cancro del colon.

Il Destrano è un agente fisico con capacità intrinseca di alterare la barriera cellulare epiteliale capace di attivare la risposta del sistema del sistema immune innato mediante la produzione di citochine immunomodulatorie. Per questo, macrofagi e neutrofili sono le prime cellule che compaiono dal primo giorno di trattamento con Destrano. Si osserva un flusso di neutrofili nel colon che si relaziona alla consistente distruzione dello stesso nell'ottavo giorno di trattamento, possibilmente attraverso la produzone di citochine e di stress ossidativo. (Kuhl AA, Kakirmann H, Hanotta M. Et al Gastroenterology 2007, 133:1882-1892; Farooq SM, Stillie R, Svenson M, Swanborg C, et al J Pharmacol Exp Ther 2009, 329:123-129).

Alla fine dell'esperimento le quantità totali ingerite sono state 53,0 ± 3,5 g/kg di DSS e 3,5 g/kg di estratto del cacao. Si è monitorato l'aspetto e il comportamento dei topi colitici e non colitici, potendo constatare che i topi sopravvivono al processo e che il loro peso medio non è stato influenzato. Il trattamento con l'estratto di cacao è stato capace di ridurre alcuni dei parametri studiati, prima tra tutte la riduzione del marcatore biochimico dell'infiammazione intestinale, attraverso l'attività della mieloperossidasi, che permette di stabilire il danno tissutale e l'infiltrazione leucocitaria.

Questo enzima è immagazzinato nei granuli azzurofili dei neutrofili ed è responsabile della produzione di specie reattive dell'Ossigeno e dell'Azoto, che giocano un ruolo fondamentale nell'infiammazione intestinale.(Olmos A, Giner RM, Máñez S Med Res Rev, Vol. 27:1-64, 2007)

Coincidendo con gli effetti manifestati per altri polifenoli, l'estratto del cacao ha ridotto l'espressione di Cicloossigenasi-2 nell'omogenato di colon (González R, Ballester I, López-Posadas R, Suarez MD, Zarzuelo A, Martínez-Agustín O, Sánchez de Medina F, Crit Rev Food Nutr 51:331- 362, 2011).

Questa riduzione potrebbe esser dovuta all'inibizione di fatori nucleari di

trascrizione come NF-κB (Andújar I, Recio MC, Giner RM, et al J Agric

Food Chem 2011).

L'Ossido Nitrico viene presentato come protagonista chiave nella membrana intestinale e nel sistema immune. Anche se cìè discrepanza nel ruolo giocato da NO da parte di i-NOS, la maggior parte degli studi usano inibitori che migliorano la colite sperimentale, il che suggerisce un'implicazione di i-NOS nella progressione della malattia. Negli omogenati di colon degli animali trattati con l'estratto di cacao, l'espressione di i-NOS è diminuita, che potrebbe contribuire all'effetto antiinfiammatorio osservato.

In conclusione, questa è la prima volta che viene studiato l'effetto di un estratto del cacao arricchito in polifenoli in un modello sperimantale di colite ulcerosa cronica. I risultati suggeriscono che la somministrazione orale di quest'estratto può ridurre il processo infiammatorio cronico potendo utilizzarsi come trattamento preventivo nell'IBD.

SESTO CAPITOLO

6. Conclusioni

E' stato messo a punto un modello di infiammazione intestinale cronica indotta con la somministrazione nell'acqua di Destrano Solfato Sodico (DSS) al 4% nella prima settimana e al 3% le due settimane seguenti. La somministrazione orale di un estratto di cacao (500 mg/kg) o di sulfasalazina (100mg/kg) ha diminuito moderatamente alcuni dei parametri valutati nei topi con colite ulcerosa cronica.

L'estratto di cacao riduce la infiltrazione leucocitaria misurata attraverso l'attività della mieloperossidasi.

A livello molecolare si è osservata nel tessuto del colon una diminuzione nella espressione degli enzimi proinfiammatori COX-2 e iNOS.

Questi risultati permettono di ipotizzare l'effetto chemioprotettore dei polifenoli del cacao nel cancro colon rettale.

Bibliografia

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Ringraziamenti

Sono il risultato di molteplici ricche esperienze in 6 anni in 3 posti diversi. Ringrazio mamma e papà che alla fine del liceo mio e di mia sorella decisero di permetterci di continuare gli studi malgrado possibili fatiche di tipo economiche. Lo decisero perché ritennero importante avere questa possibilità che loro non ebbero a vent'anni ma che si diedero da grandi. Mio padre è diventato psicologo all'età di 50 anni, mia madre iscritta al secondo anno di lettere con indirizzo arte all'università di Bergamo, potendo così coronare sogni e hobbies..

Iniziai a Milano, una città non propriamente universitaria, prima la città del lavoro, e soprattutto iniziai da pendolare. Impiegavo circa un'ora e mezza da casa ad aula, entrando con la miriade di impiegati di ufficio brianzoli e riuscendo con gli stessi. Stress e discorsi poco stimolanti erano piatti certi.. Andai in piena crisi (Grazie Milano!) ed ebbi l'opportunità di fare un percorso con una donna splendida che qui approfitto per ringraziare, Silvana Cominetti, omeopata medico-chirurgo, con la quale scavammo nel passato e che mi aiutò a risolvere la separazione dei miei genitori avvenuta ad un anno di vita. Non mi diede soluzioni, mi diede strumenti per conoscermi meglio, chissà è la migliore delle soluzioni. Alla fine del percorso mi confessò di esser stata la sua più grande soddisfazione. Grazie Silvana! Lei alimentò la possibilitò di innalzare ambizioni e di costruire un trasferimento pisano, se era ciò che volevo.

Fu così che il terzo anno di università piombai in un altro mondo. Grazie Pisa! Città universitaria, rossa toscana piena di giovani, si contan migliaia di famiglie di ventenni in cambiamento. In bicicletta e a piedi raggiunger l'università era diventato un gioco da ragazzi, qualità di vita aumentata enormemente!

A Pisa tra le persone non ci son barriere così difficili da oltrepassare che esistono a Milano, le relazioni interpersonali son di scambio, più semplici e spontanee, più sane quindi. Esiste

Mi ha fatto scoprire la possibilità di lavorare con le persone, nel grande anno di proteste, mi ha fatto sfogare la necessità di esprimere il

disaccordo rispetto a ingiustizie. In quel periodo pensavo avremmo cambiato il mondo! Dopodiché ebbi la delusione che no, ma a posteriori riesco a vedere come ha cambiato me, come mi ha arricchito.

La mia voglia di imparare ha fatto sì che nel momento in cui il quinto anno le lezioni erano poche, sia andata a seguir qualcosa che mi interessava approfondire, storia contemporanea alla facoltà di storia e spagnolo alla facoltà di lingue.

In questo stesso anno decisi di intraprendere un altro percorso con un'altra donna splendida, Laura, una maestra di Yoga, una maestra di vita. Queste donne che supportano al cambiamento. Lei mi diede altri strumenti, di respirazione, di postura, ma anche forme di pensiero, attenzione ai gesti, lavoro di coppia, automassaggio, strumenti difficile da acquisire, ma che quando ottieni è fatta. Imparare a sentire il proprio corpo, dolori e piaceri, e cercare di avere soddisfazioni da quello che fai. A parte la mia voglia di imparare è forte in me anche la voglia di trasmettere quello che so, lavorando con altra gente, mettendola in attività. Riuscimmo con amici artisti a montare un evento di Body Painting con reading musica con il tema dei chakra..Quello che riuscimmo davvero a creare, fu uno spazio di libera espressione, nella quale le barriere tra le persone non esistevano. Speciale! Grazie Ragazzi!

Dopo quell'evento la mia sensazione fu di aver ottenuto tanto a livello personale a Pisa, da desiderare un altro posto, uscire dall'Italia per la tesi.

Grazie alla professoressa Lapucci e Pistelli e JuanLuis Rios Canavate ottenni una borsa di studio per 9 mesi a Valencia. Grazie Valencia!

Lì mi sperimentai totalmente, nuova lingua nuova gente nuova vita. E ti presenti come vuoi, come ti senti, senza pregiudizi famigliari e di persone che ti conoscono da sempre e che sempre vorrebbero vederti così. Grazie ai miei nonni pugliesi per aver lavorato con me a Valencia in uno splendido laboratorio di pasta fresca in un locale!

Ed eccomi quì, contenta della formazione ottenuta, dei percorsi variegati, e inevitabilmente preoccupata dell'entrata nel mondo del lavoro, in un

mondo in crisi, mi piacerebbe rispondere a quella che trovo la crisi di un sistema coi fatti. Mi piacciono tanto I procedimenti di laboratorio e le conoscenze di questo corso di laurea applicate al quotidiano, in cucina, nell'orto, lavoarare con la gente e con l'autoproduzione che fa sì che si riceva una grande soddisfazione.

Grazie a mia sorella che sento così vicina seppur lontana negli Usa, sento gli stessi intenti ed interessi pur partendo da due formazioni apparentemente inconciliabili come la mia e il diritto.

Termino ringraziando tutte le persone che ho incrociato nel cammino, che nel bene o nel male, mi hanno aiutato a crescere, cambiare, le famiglie, la mia quella di Lucca, di Valencia.