Determinazione di tossine ASP mediante HPLC

La cromatografia in fase liquida è una tecnica analitica che si può definire come un metodo fisico di separazione, nel quale i componenti da separare si distribuiscono tra due fasi: la fase fissa o stazionaria attraverso la quale si muove la fase definita mobile. La separazione è dovuta alla differenza nei coefficienti di distribuzione dei singoli componenti del campione tra le due fasi.

Nel nostro caso il metodo di cromatografia utilizzata è quello di “ripartizione a fase inversa”, nella quale la fase stazionaria è apolare e la fase mobile è un liquido polare, con eluizione isocratica, cioè con composizione della fase mobile costante nel tempo. La colonna cromatografica è costituita da impaccamento in silice derivatizzata con un idrocarburo lineare a 18 atomi di carbonio (C18); in questo modo la silice, fase stazionaria

fortemente polare, grazie alla presenza delle catene C18 diventa una fase stazionaria

fortemente apolare.

La moderna cromatografia in fase liquida è caratterizzata da pressioni d’ingresso molto elevate, per questo viene definita anche “cromatografia liquida ad alta pressione” o “cromatografia liquida ad alte prestazioni”, a differenza delle prime tecniche di cromatografia nelle quali il flusso della fase mobile veniva ottenuto semplicemente per gravità.

Il controllo del flusso della fase mobile viene fatto dalla pompa, che può regolare la pressione esercitata (pressione costante, in Pascal) oppure il flusso di essa (flusso costante, in mL/min.); tanto più veloce è il flusso della fase mobile, tanto più rapido è il movimento del campione attraverso il sistema. I campioni liquidi vengono iniettati direttamente, mentre i campioni solidi devono essere disciolti in un solvente, che può anche non essere quello impiegato come fase mobile; è inoltre conveniente allontanare eventuali particelle solide mediante filtrazione o centrifugazione perché potrebbero causare il blocco dello strumento di iniezione e delle colonne.

Generalmente si opera a temperatura ambiente o comunque non sopra i 60-70°C.

L’analisi qualitativa si basa sull’identificazione del picco e si esegue con l’ausilio dei “tempi di ritenzione” (che corrispondono al massimo del picco e quindi alla più alta concentrazione di analita), che vengono confrontati con i dati ottenuti analizzando nelle medesime condizioni, degli standard conosciuti. Per avere la certezza che non siano presenti interferenti è sempre consigliabile condurre anche delle analisi in bianco,

determinare se introducono o meno delle contaminazioni indesiderate nell’analisi cromatografica.

L’analisi quantitativa è basata sulla misura delle aree dei picchi, che sono direttamente proporzionali alla quantità, ovvero alla concentrazione, dell’analita.

Da notare come altezza e area del picco cromatografico siano proporzionali. Una volta calcolata l’area del picco questa viene confrontata con l’area del picco che ci fornisce lo standard; questo procedimento richiede l’iniezione di campioni di uguale volume. Pertanto è raccomandabile iniettare innanzitutto ripetutamente un certo volume di soluzione standard a concentrazione nota, precedentemente preparata, per vedere se le analisi ripetute concordano con i limiti di riproducibilità richiesti.

Un campione quindi fluisce lungo la colonna cromatografica mediante la fase mobile e durante questo percorso le singole sostanze vengono rallentate dalla fase stazionaria in funzione delle interazioni che si generano tra i componenti del campione, la fase mobile e la fase stazionaria. Se non vi fossero interazioni le molecole del campione viaggerebbero attraverso la colonna con la stessa velocità della fase mobile.

Tale tecnica analitica permette l’identificazione e la determinazione degli acidi domoico ed epi-domoico (DA+epi-DA) in molluschi bivalvi.

L’acido domoico viene estratto dalla polpa dei molluschi con una soluzione metanolo:acqua 1:1 (v/v) e, dopo filtrazione, viene determinato mediante HPLC in isocratica su colonna C18 a fase inversa, con rivelazione spettrofotometrica UV alla

lunghezza d’onda di 242 nm (Fig. 25).

I rivelatori ottici utilizzati in HPLC consistono in un raggio luminoso che viene fatto passare attraverso il liquido in uscita dalla colonna; le variazioni di intensità della luce, per assorbimento di raggi UV, emissioni fluorescenti, o mutamenti nell’indice di rifrazione (a seconda del rivelatore usato), provocate dal passaggio dei componenti del campione attraverso la cella, vengono trasformate in una variazione della tensione di uscita. Queste variazioni vengono inviate ad un registratore potenziometrico o immesse in un sistema di elaborazione computerizzato. Un rivelatore in grado di misurare l’assorbimento di raggi ultravioletti a lunghezza d’onda variabile operante tra 190 e 350 nm, è adatto alla rivelazione di quasi tutte le sostanze. Se si conoscono le proprietà del campione da analizzare è semplice decidere il tipo di rivelatore da utilizzare e la lunghezza d’onda di lavoro: si sceglierà di solito la lunghezza d’onda alla quale il campione presenta un massimo d’assorbimento.

La preparazione del campione consiste nell’apertura del mollusco mediante il taglio dei muscoli adduttori e nella rimozione della polpa, la quale viene lasciata scolare per 5 minuti; vengono pesati e omogeneizzati circa 100 g e un’aliquota di 4 g di campione viene addizionata con 16 mL di soluzione estraente metanolo:acqua 1:1 (v/v) in una provetta da 30 mL circa. Si estrae utilizzando un omogeneizzatore ad immersione per 3 minuti a 10.000 rpm e si centrifuga l’estratto a 3000 rpm per 10 minuti. Si filtra una porzione di surnatante attraverso un filtro da 0.20 µm e la si trasferisce in un vial per autocampionatore.

Per la separazione cromatografica si utilizza un’eluizione isocratica a 40°C, con un flusso della fase mobile di un 1 mL/min; il volume di campione iniettato è di 20 µl.

Prima di ogni serie analitica è indispensabile determinare il “bianco-reagente” applicando l’intero metodo di analisi, tralasciando la porzione di campione per l’analisi; nel cromatogramma non dovrebbero essere presenti picchi interferenti con l’acido domoico. L’identificazione dell’acido domoico si ottiene confrontando il tempo di ritenzione del picco del campione ed il tempo di ritenzione del picco degli standard di acido domoico. La determinazione quantitativa si ottiene interpolando l’area del picco dell’acido domoico con la curva di calibrazione (retta di taratura); la concentrazione, espressa in mg di acido domoico su kg di polpa viene calcolata secondo la seguente equazione:

Equazione della retta per la curva di taratura: y = ax + b

y: area del picco dell’acido domoico del campione a: coefficiente angolare della curva di taratura x: concentrazione della soluzione di riferimento b: intercetta della curva sull’asse delle y

VT: volume totale dell’estratto (20 mL)

W: peso della polpa del campione in g (di solito 4 g) D: fattore di diluizione (se l’estratto è stato diluito) Rm: recupero medio (%)