La determinazione dei polifenoli totali viene eseguita mediante il metodo di Folin- Ciocalteau89.
Si preparano 5 soluzioni di catechina (Sigma-Aldrich), utilizzata come polifenolo di riferimento, in metanolo a concentrazioni comprese tra 20 e 300 mg/l. In matracci da 20 ml, ad 1 ml di ciascuna soluzione, sono aggiunti: 1 ml di metanolo, 5 ml d’acqua, 1 ml di reattivo di Folin-Ciocalteau e, dopo 5 minuti, 4 ml di carbonato di calcio 10% w/v. Si porta a volume con acqua distillata e si legge l’assorbanza a 700 nm dopo 90 minuti d’incubazione a 30°C. La concentrazione di polifenoli in soluzione è calcolata tramite la seguente retta di taratura (Figura
Materiali e metodi
145 Catechina (mg/ml) = (Abs 700nm + 0,005)/9,8561
Figura 5.10: Retta di taratura per la determinazione dei polifenoli totali a 30°C.
Polifenoli (µmol/min) =
t = tempo di reazione (minuti) Vtot = volume totale di reazione (ml) Venz = volume enzima aggiunto (ml)
Per la determinazione dei polifenoli totali, al fine di eliminare sostanze organiche che possono interferire nella lettura, si effettua un passaggio in cartuccia C-18 end-capped, Phenomenex-Strata, 1.0 g/ 6 ml, secondo il metodo descritto di seguito: si lava la cartuccia con 2 ml di metanolo e si condiziona con 5 ml d’acido solforico 0.01 N. Si adsorbe 1 ml di campione, opportunamente diluito in acido solforico 0.1 N per ottenere un’assorbanza compresa nel range della retta di taratura, e si aggiungono 2 ml d’acido solforico 0.01 N. Si collega la cartuccia ad un matraccio da 20 ml e si eluisce con 2 ml di metanolo e 5 ml d’acqua distillata. Al contenuto del matraccio si aggiunge 1 ml di reattivo di Folin-Ciocalteau e, dopo 5 minuti, 4 ml di carbonato di sodio 10 % w/v portando poi a volume con acqua. Dopo 90 minuti si legge l’assorbanza a 700 nm, avendo cura di centrifugare il campione per sedimentare il precipitato di carbonato che si forma, contro un bianco preparato in un matraccio da 20 ml contenente tutti i reagenti e 2 ml di metanolo non contenente fenoli.
y = 9,8561x + 0,005 R² = 0,9993 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 A b s (700 n m ) Catechina (mg/ml)
Materiali e metodi
5.8
Valutazione delle eventuali attività enzimatiche sugli scarti
della produzione di Champignon
Recupero enzimatico dagli scarti del fungo:
A 95 g* di gambetto (o parte inferiore) del fungo macinati, si aggiungono 30ml di acqua distillata. Il tutto viene mescolato ed in seguito si recupera la frazione liquida che verrà sottoposta agli saggi spettrofotometrici per la determinazione delle attività enzimatiche presenti.
Recupero enzimatico dagli scarti del fungo:
A 50 g di terriccio si aggiungono 30 ml di acqua distillata. Il tutto viene mescolato ed in seguito si recupera la frazione liquida che verrà sottoposta agli saggi spettrofotometrici per la determinazione delle attività enzimatiche presenti.
*Le attività presenti sia nel fungo che nel terriccio sono riferite a 50 g di biomassa.
5.9
Strumenti di laboratorio
Spettrofotometro 923, Double Beam UV/VIS - UVIKON;
Termoshake – GERHARDT ;
pH-metro micro pH 2001 - CRISON;
Centrifuga Micro 20 - HETTICH;
Stufa a ventilazione forzata – FALC;
Autoclave – PBI INTERNATIONAL;
Cappa biologica a flusso laminare – GEMINI;
Liofilizzatore – SCANVAC COOLSAFE;
Spray Dryer SD-05 – LABPLANT;
147 Ringraziamenti
Dedico questo lavoro di tesi ai miei amori: Mauro e Leonardo Baldini che riempiono la mia vita d’amore e felicità!
Grazie coração per l’infinita pazienza, comprensione, supporto, amicizia, amore e per il regalo più bello e prezioso: nostro figlio! Grazie di tutto, sono molto felice di amarti e di potere contare sempre con la tua amicizia! Eu amo você!
Leonardo, non potevo veramente capire la grandezza dell’amore prima del tuo arrivo. Mi trasformi costantemente in una persona migliore. Grazie di avermi fatto conoscere l’amore senza limiti. Tutte le cose hanno preso un nuovo significato e niente è più importante di te! Ti amo infinitamente!!!!
Mãe querida, obrigada por tudo! Você é o meu exemplo, a minha força, a minha melhor amiga, o meu porto seguro! Eu te amo sempre…… eu amo mais!!!!!!! Obrigada pai, pelo incentivo ao estudo, pelo exemplo de responsabilidade, determinação e dedicação. Obrigada por partecipar desse momento importante! Amo você!
Jefferson e Mayra, a vida não seria a mesma sem vocês. Eu amo muito vocês e me sinto sempre orgulhosa e honrrada por ser vossa irmã. Obrigada por cada momento e pelos sobrinhos maravilhosos!
Ana Paula querida, tive o prazer de escolher uma grande amiga para fazer parte da minha vida e fui tão sortuda que ela virou minha cunhada. Te adoro demais! Monja, un grazie speciale a te che hai preso cura del mio gioiello più prezioso come se fosse tuo. Ti sei rivelata una vera amica e sono felicissima e onorata di averti nella nostra vita. Grazie!
Grazie al professore Setti (Sevens) per la preziosa conoscenza trasmessa, per l’immensa pazienza, amicizia e semplicità; ma soprattutto, per le fantastiche canzoni (Sevens Compilation) che rallegrano le nostre giornate di lavoro e ci fanno capire che la serietà sul lavoro deve andare di pari passo con la giusta e sana “leggerezza”.
Ragazzi del laboratorio, come ringraziarvi???? Passiamo la maggior parte della giornata insieme, ridendo e condividendo le nostre storie assurde. Barbara, Ilaria, Elena, Francesco, Ruggero, Alberto e Valentina, vi adoro!!!!! Grazie veramente di tutto, soprattutto della amicizia!
Alessandra, Fabio e Claudio: i miei piccini! Mi sento davvero orgogliosa di avere avuto il privilegio di essere stata vostra correlatrice e di avere condiviso un periodo importante insieme a voi. Il vostro futuro sarà sicuramente pieno di successo e realizzazioni. Siete bravissimi!!!
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