Il modello sperimentale sul quale sono stati effettuati gli esperimenti riportati in questa tesi è costituito da cellule HL-60 e NB4 indotte a differenziare in presenza di 1 µM ATRA per 4 giorni. Un primo gruppo di esperimenti ha avuto lo scopo di stabilire se Vav1 sia coinvolto nella regolazione del pool proteico attraverso il quale l’ATRA completa il processo maturativo di precursori APL-derivati. E’ stata pertanto condotta un’analisi proteomica di cellule HL-60 e NB4 indotte a differenziare in presenza di ridotta quantità o fosforilazione tirosinica della proteina.
Come dimostrato precedentemente dal nostro gruppo di ricerca, in seguito al trattamento con ATRA, in entrambe le linee cellulari, Vav1 aumenta in quantità e fosforilazione tirosinica (Fig. 13). La somministrazione di Picetannolo, inibitore farmacologico specifico per la tirosina chinasi Syk, durante il trattamento differenziante, riduce significativamente i livelli di fosforilazione della proteina (Fig.13).
Figura 13. Lisati cellulari da cellule HL-60 e NB4 coltivate in presenza (+) o meno (-) di ATRA e/o Picetannolo sono stati sottoposti ad analisi immunochimica con gli anticorpi indicati. L’ibridazione con l’anticorpo anti-β-tubulina ha consentito di verificare l’equivalenza delle cariche proteiche. L’analisi densitometrica è stata riportata sotto forma di unità arbitrarie (a.u.). I dati sono rappresentativi di 3 diversi esperimenti.
ATRA
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++++
++++
Piceatannol----
++++
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++++
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- ---++++
---- ++++
++++ ++++
WB: P-tyrHL-60
NB4
a.u. 5.6 2.2 9.1 5.4 4.7 2.9 15.2 7.7 WB: Vav1 a.u. 12.0 12.1 25.5 27.2 36.7 32.7 45.1 48.5 WB: ββββ-tubulin a.u. 42.2 39.2 39.0 41.0 45.8 44.5 40.2 43.1L’aumento di Vav1 indotto dall’ATRA è stato contrastato mediante l’inibizione della traduzione del suo messaggero utilizzando la tecnica del siRNA. L’effettiva riduzione della proteina nel corso del trattamento differenziante è stata verificata, in entrambe le linee cellulari, mediante analisi immunochimica con l’anticorpo diretto contro Vav1 (Fig. 14).
L’analisi mediante citometria a flusso dell’espressione dell’antigene di superficie CD11b ha consentito di valutare i livelli di differenziamento raggiunti da cellule nelle quali la quantità o la fosforilazione tirosinica di Vav1 sono state down-modulate (Fig. 15).
0 50 100 150 200 250 300 M e a n F lu o re s c e n c e I n te n s it y ( M F I) Control siRNA Piceatannol ATRA siRNA+ATRA ATRA+Piceatannol
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*
HL-60 NB4Figura 14. Lisati cellulari ottenuti da cellule HL-60 e NB4 soggette a down-modulazione dell’espressione di Vav1 (siRNA) coltivate in presenza (+) o meno (-) di ATRA sono stati sottoposti ad analisi immunochimica con gli anticorpi indicati. L’ibridazione con l’anticorpo anti-β-tubulina ha consentito di verificare l’equivalenza delle cariche proteiche. L’analisi densitometrica è stata riportata sotto forma di unità arbitrarie (a.u.). I dati sono rappresentativi di 3 diversi esperimenti.
C siRNA C siRNA ATRA
-
-
++++
++++
-- --
-- --
++++
++++
WB: Vav1 WB: ββββ-tubulin C siRNA C siRNAHL-60
NB4
a.u. 22.5 8.8 35.8 12.5 27.8 14.1 40.5 22.2 a.u. 33.4 35.3 38.9 40.8 42.5 42.3 41.2 40.1Figura 15. Valutazione citofluorimetrica dell’espressione dell’antigene di superficie CD11b in cellule HL-60 e NB4 coltivate in condizione di controllo, sottoposte a down-modulazione dell’espressione (siRNA) o della fosforilazione (Piceatannol) di Vav1 nel corso del differenziamento con ATRA. I dati sono rappresentativi di tre esperimenti. Gli asterischi rappresentano valori significativamente diversi.
Come atteso, il livello di differenziamento raggiunto da cellule indotte a maturare in presenza di una ridotta quantità di Vav1 è significativamente ridotto (Fig.15). Al contrario, la riduzione della fosforilazione tirosinica Syk-dipendente di Vav1 non incide significativamente sul livello di differenziamento granulocitario raggiunto da entrambe le linee cellulari (Fig. 15), confermando dati ottenuti precedentemente dal nostro gruppo di ricerca.
Allo scopo di stabilire se Vav1 è coinvolto nella modulazione dell’espressione del pool proteico ATRA-indotto, lisati cellulari nelle diverse condizioni sperimentali sono stati sottoposti ad elettroforesi bidimensionale ed analisi delle mappe proteiche, secondo quanto riportato nella sezione “Materiali e Metodi”.
Negli esperimenti preliminari, per la realizzazione della focalizzazione isoelettrica delle proteine è stato utilizzato un intervallo di pH compreso fra 3 e 10. Poiché la maggior parte degli spots proteici era localizzata nella regione centrale di pH (dati non mostrati), gli esperimenti successivi e presentati in questa tesi sono stati compiuti usando un intervallo di pH, più ristretto, compreso tra 4 e 7.
All’isoelettrofocalizzazione è seguita la separazione elettroforetica e, dopo colorazione dei gels di poliacrilammide con Blu Coomassie colloidale, questi ultimi sono stati acquisiti mediante densitometro e le mappe proteiche così ottenute sono state valutate con un software dedicato (PDQuest), come descritto nella sezione “Materiali e Metodi”. Le Figure 16 ed 17 riportano, rispettivamente, un esempio di separazione bidimensionale di proteine da cellule HL-60 e NB4 differenziate con ATRA, in presenza di una ridotta quantità o fosforilazione tirosinica di Vav1.
In ogni gel, sono stati rintracciati fino a 500 spots dei quali, dopo normalizzazione e pulizia delle mappe, 350 sono stati sottoposti all’analisi mediante PDQuest. Gli spots selezionati, nelle diverse condizioni sperimentali, sono stati paragonati per individuare quelli corrispondenti a proteine la cui espressione mostrava un alto grado di variabilità (200% o più).
Dopo analisi di esperimenti multipli (n = 3), per ogni linea cellulare sono stati individuati 23 spots che comprendevano 3 proteine la cui espressione appariva costante e 20 la cui quantità si modificava significativamente nelle diverse condizioni sperimentali. Gli spots sono stati quindi prelevati dal gel, sottoposti a digestione triptica delle proteine e i peptidi così ottenuti sono stati analizzati mediante spettrometria di massa presso il laboratorio del Dr. Candiano all’ospedale Gaslini di Genova.
sono stati identificate con certezza 12 proteine sia nelle cellule HL-60 (Fig. 16) che nelle cellule NB4 (Fig. 17). Di queste, per ogni linea cellulare, 3 corrispondevano alle proteine i cui spots apparivano di intensità costante e sono state identificate come actina (Fig. 16, 17, spot 1) calreticulina (Fig. 16, 17, spot 2), e cofilina-1 (Fig. 16, 17, spot 3).
Tutte le proteine identificate, insieme alle caratteristiche che ne hanno consentito l’identificazione e al loro ruolo funzionale, sono riportate in Tabella 3 e 4, rispettivamente per la linea cellulare HL-60 e NB4.
E’ possibile osservare come nella linea cellulare HL-60, quando l’espressione di Vav1 è stata down-modulata durante il trattamento con ATRA, 5 proteine aumentano (Tabella 3 e Fig. 16, spots 4-8) e 4 diminuiscono (Tabella 3 e Fig. 16, spots 9-12) la loro espressione. Anche nella linea cellulare NB4 sono state identificate 5 proteine che aumentano la loro espressione (Tabella 4 e Fig. 17, spots 4, 6, 13-15) e 4 la cui quantità diminuisce (Tabella 4 e Fig. 17, spots 9, 12, 16, 17).
Quando la fosforilazione tirosinica Syk-dipendente di Vav1 è specificatamente inibita grazie alla somministrazione dell’inibitore farmacologico Picetannolo, solo una proteina, l’α-tubulina, appare down-modulata in entrambe le linee cellulari. E’ interessante notare come l‘α-tubulina appaia invece up-regolata quando l’espressione di Vav1 è ridotta mediante il silenziamento del suo messaggero (Tabelle 3, 4 e Fig. 16, 17, spot 6). Questo suggerisce che la fosforilazione tirosinica Syk-dipendente di Vav1 non sia coinvolta nella modulazione in toto di proteine ma regoli più specificatamente l’espressione di proteine appartenenti al citoscheletro. Questo risultato supporta dati precedenti del nostro gruppo di ricerca che riportano come la fosforilazione tirosinica di Vav1 sia cruciale per ottenere le modifiche della morfologia nucleare che si verificano nel differenziamento ATRA-indotto di promielociti APL-derivati (Bertagnolo et al., 2001 b).
Figura 16. Elettroforesi bidimensionale di lisato totale di cellule HL-60 differenziate per 4 giorni con ATRA in condizioni di ridotta espressione (siRNA+ATRA) o fosforilazione tirosinica (Piceatannol+ATRA) di Vav1. Le proteine sono state separate nella prima dimensione secondo il gradiente di pH 4-7. La seconda dimensione ha consentito di separare proteine di peso molecolare compreso tra 15 e 150 KDa. Le mappe sono rappresentative