Ad oggi, esiste ampia evidenza che i disordini di natura allergica come l’asma umana e la RAO equina, siano mediati dallo stress ossidativo. L’esposizione eccessiva a ROS e NOS è la chiave di questo stress e porta al danno proteico, lipidico e acido- nucleico (Bowler et al., 2002).
Pazienti asmatici mostrano incrementi di perossido di idrogeno e ossido nitrico rispetto a soggetti sani, e questi incrementi sono dovuti all’infiammazione delle vie aeree. Infatti, macrofagi, eosinofili e monociti di persone asmatiche producono più superossido delle cellule di persone sane, senza contare la quantità di ROS liberate dai neutrofili richiamati dal processo infiammatorio. L’aumento dei ROS, soprattutto durante le crisi asmatiche, supera la capacità antiossidante endogena e causa danni ossidativi sia alle cellule epiteliali che endoteliali. Inoltre, i ROS diminuiscono la funzione β-adrenergica polmonare e sensibilizzano la muscolatura liscia alla contrazione acetilcolina-indotta, aggravando la costrizione delle via aeree causata anche dall’accumulo di muco e dall’iperplasia che si verificano nei pazienti asmatici (Bowler et al., 2002).
Considerata la somiglianza ezio-patologica dell’asma umana con la RAO equina, numerosi studi sono stati preposti a valutare lo stato ossidativo anche in medicina veterinaria, indagando sia marker dell’ossidazione, che sostanze antiossidanti, sia a livello polmonare che sistemico. E’ riportato un aumento di sostanze ossidanti come GRR e GSSG (Kirschvink et al., 1999; Robinson et al., 2001; Kirschvink et al., 2002b), isoprostani (Kirschvink et al., 1999b; Robinson et al., 2001) e conta neutrofilica (Kirschvink et al., 1999; Robinson et al., 2001) nel polmone di cavalli dopo esacerbazione dei sintomi, indicando un coinvolgimento del danno ossidativo locale nello sviluppo della malattia. Inoltre, la percentuale di neutrofili e lo score infiammatorio delle vie aeree (Moore et al., 1985) correlano con lo stress ossidativo, così come la meccanica respiratoria e l’esame dei gas espirati (Kirschvink et al., 2002b).
Il ruolo del danno ossidativo a livello locale è confermato anche dal calo delle difese antiossidanti polmonari, sia per quanto riguarda l’enzima SOD (Niedzwieds et al., 2014) che per l’acido ascorbico (Deaton et al., 2005b).
In effetti, inizialmente si verifica un aumento della capacità antiossidante polmonare, probabilmente legata alla cronicità della malattia ed alla stimolazione continua alla
produzione di sostanze antiossidanti, mentre con il perdurare della crisi si manifesta l’abbassamento del potere antiossidante (Bowler et al., 2002).
L’alterazione dell’equilibrio tra sostanze ossidanti ed antiossidanti ha ripercussioni a livello sistemico, dove si verifica l’aumento di acido urico, la cui produzione e’ associata alla presenza di ROS (Kirschvink et al., 1999). Inoltre, la concentrazione di GSH plasmatico è aumentata nei cavalli con RAO in remissione. L’incremento di questa sostanza antiossidante a livello sistemico indica una risposta adattativa dell’organismo allo stress ossidativo cronico che si manifesta a livello polmonare (Kirschvink et al., 2002b).
A mia conoscenza, non esistono attualmente studi rivolti alla valutazione di AOPP e NPBI nel PELF dei cavalli affetti da RAO o IAD.
In ogni caso, l’aumento dei livelli degli AOPP ematici e’ stato dimostrato in varie malattie umane associate a stress ossidativo, come aterosclerosi, insufficienza renale sia acuta che cronica, mastocitosi, sindrome metabolica. (Colombo et al., 2015). In medicina veterinaria, uno studio eseguito su vitelli sani ha evidenziato un calo progressivo e graduale degli AOPP dal momento del parto, evento associato ad elevato stress ossidativo, fino allo svezzamento, sia nel sangue che nel condensato respiratorio (Ranade et al., 2014). Sempre nella specie bovina, l’incremento di AOPP è associato a perdita embrionale ed infiammazione acuta (Po et al., 2012). Per quanto riguarda la patologia equina, uno studio riporta l’aumento degli AOPP ematici in corso di toxoplasmosi, a causa dell’ossidazione associata allo stato infiammatorio indotto dal parassita (Do Carmo et al., 2014). Inoltre, uno studio preliminare eseguito su puledri trottatori ha evidenziato un aumento di questo prodotto dell’ossidazione proteica nell’esalato respiratorio dell’unico puledro affetto da patologia respiratoria rispetto ad altri 10 puledri sani (Po et al., 2012).
Per quanto riguarda il NPBI, esso e’ stato identificato in medicina umana come il più accurato indicatore di rischio di “Free Radical-related Disease” in neonati prematuri (Perrone et al., 2010), ed e’ elevato in caso di sindrome da distress respiratorio e “Chronic Lung Disease” (Kime et al., 1996). Non è stato identificato un range di riferimento per il BALF dei cavalli, per cui in questo studio i valori riscontrati in equidi sani, affetti da IAD o affetti da RAO sono stati confrontati con quello dei bambini sani, che e’ 0.06-0,99 µmol/L (Kime et al., 1996).
In questo studio, d-ROMs, NPBI e AOPP nel BALF dei soggetti sani sono risultati in basse concentrazioni. Quindi, in soggetti senza infiammazione attiva delle vie respiratorie, non si verificava un aumento dei marker dell’ossidazione, in accordo con quanto riportato da studi precedenti (Paffetti et al., 2006; Perrone et al., 2010; Po et al., 2012; Gangemi et al., 2015).
D’altro canto, questi tre parametri dell’ossidazione erano significativamente più elevati in animali affetti da IAD e RAO rispetto ai controlli sani. Questi dati indicano che in entrambe queste malattie era presente un certo grado di stress ossidativo legato all’infiammazione polmonare, anche se di natura cronica. L’aumento di queste sostanze è documentato in vari studi che, pur non riguardando direttamente il polmone o il BALF, correlano il loro incremento con la presenza di stress ossidativo. Per quanto riguarda gli AOPP, sebbene essi non siano stati dosati nel BALF degli equidi, il loro aumento rispecchia quello riscontrato in altri studi sia in medicina umana che veterinaria sullo stato ossidativo indotto da malattie di varia natura (Po et al., 2012; Do Carmo et al., 2014; Ranade et al., 2014; Colombo et al., 2015). Lo stesso si può dire per il NPBI (Kime et al., 1996; Perrone et al., 2010) e per i d- ROMs. Questi ultimi risultavano aumentati nel sangue di cavalli sottoposti ad esercizio intenso, in conseguenza all’aumentato stress ossidativo (Tsubone et al., 2013). In un altro studio condotto su puledri affetti da polmonite rodococcica, i d- ROMs risultavano significativamente più elevati nel condensato respiratorio dei soggetti colpiti che non nei controlli sani (Crowley et al., 2013).
Oltre questi tre parametri, studi riportano un aumento anche di altre sostanze ossidanti in corso di malattie infiammatorie polmonari. Per esempio, cavalli affetti da RAO hanno aumenti polmonari di isoprostani (Kirschvink et al., 1999), glutatione ossidato (Kirschvink et al., 1999; Robinson et al., 2001; Kirschvink et al., 2002b) e perossido d’idrogeno (Dekhijzen et al., 1996). Ancora, puledri affetti da polmoniti di varia natura hanno aumenti di H2O2 nell’espirato e alti livelli di AOPP nel sangue (Crowley et al., 2013; Po et al., 2013). Quindi, l’aumento di sostanze pro-ossidanti (d-ROMs e NPBI) e ossidanti (AOPP) riportate in questo studio è in accordo con i risultati di altre ricerche ma riguardanti altri parametri.
Inoltre, i soggetti affetti da IAD mista avevano valori di d-ROMs, NPBI e AOPP maggiori di quelli affetti da RAO. Sebbene la differenza non fosse statisticamente significativa per nessuno di questi tre parametri dell’ossidazione. In ogni caso, questo trend potrebbe essere spiegato da una maggiore attivazione di macrofagi e
neutrofili nei soggetti con IAD rispetto a quelli con RAO in fase di remissione. Nei soggetti affetti da IAD mista è stata riscontrata anche una correlazione positiva tra d-ROMS e AOPP (p<0,01; r=0,726). Poichè i primi sono pro-ossidanti e i secondi sono prodotti finali dell’ossidazione, è normale attendersi, in uno stato infiammatorio attivo come quello indotto dalla IAD, che all’aumento degli uni corrisponda l’aumento degli altri. Probabilmente, il mancato riscontro di questa correlazione nel gruppo RAO e’ dovuto al fatto che tutti i soggetti erano in fase di remissione, cioè in una fase nella quale le sostanze pro-infiammatorie vengono liberate in quantità inferiori rispetto alla IAD. A supporto di questa ipotesi, la concentrazione dei d- ROMs è più bassa nel gruppo RAO che in quello IAD mista, anche se la differenza non è statisticamente significativa.
Per quanto riguarda la concentrazione dei BAP, questa è significativamente più alta nel gruppo IAD rispetto ai sani. L’aumento della capacità antiossidante polmonare è probabilmente legata alla stimolazione continua e acuta del processo infiammatorio, a causa della produzione di sostanze ossidanti da parte di neutrofili e macrofagi (Colombo et al., 2015).
Anche nel gruppo “RAO”, la concentrazione di BAP è più alta rispetto al gruppo “sani”, seppur non in modo statisticamente significativo. Questo risultato non sorprende perchè, come nella IAD, inizialmente si verifica un aumento della capacità antiossidante polmonare per l’esposizione agli ossidanti, ed è solo con il perdurare delle crisi di RAO che se ne manifesta l’abbassamento (Bowler et al., 2002). I cavalli analizzati in questo studio sono affetti da RAO ma asintomatici, per cui il potere antiossidante, valutato come BAP in questo studio, è ancora normale.
Per questa ragione, i risultati di questo studio non vanno interpretati come in contrasto con il calo di acido ascorbico, il principale antiossidante polmonare, riscontrato da Deaton et al. (2006) in una popolazione di RAO in crisi.
Sebbene i BAP dei soggetti con RAO siano risultati in generale più bassi di quelli con IAD, non è stata riscontrata alcuna differenze statisticamente significativa tra i due gruppi. In ogni caso, la differenza potrebbe essere dovuta al fatto che la RAO induce un’infiammazione più lieve della IAD ma più duratura, con conseguente calo delle difese antiossidanti.
L’aumento delle difese antiossidanti in corso di infiammazione polmonare e’ in linea con quanto riscontrato in altri studi. Niedzwiedz et al. (2014) riportano un aumento
controlli sani. Queste due sostanze sono enzimi antiossidanti fondamentali al mantenimento dell’equilibrio ossidativo. Durante le fasi iniziali dell’infiammazione polmonare, l’aumento del rilascio di ROS causa in risposta l’aumento anche di sostanze antiossidanti, per mantenere l’omeostasi (Niedzwiedz et al., 2014). Questo meccanismo compensatorio si verifica anche in cavalli posti sotto sforzo massimale: all’incremento dei ROM a causa dell’esercizio intenso corrisponde un aumento dei BAP, in modo da mantenerne l’equilibrio (Tsubone et al., 2013).
In conclusione, questo studio ha confermato, nel BALF di equidi affetti da RAO e IAD mista, l’aumento del potenziale ossidativo, valutato in base a sostanze pro- ossidanti (d-ROMs e NPBI) e ossidante (AOPP). Parallelamente, ha anche verificato l’aumento delle difese antiossidanti a livello polmonare, valutate in questo caso come BAP.
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RINGRAZIAMENTI
Innanzitutto, vorrei ringraziare la Dott.ssa Sgorbini per gli insegnamenti di questi due anni e per tutto l’aiuto datomi sia per la stesura della tesi, sia per riuscire ad andare in Erasmus a fare un’esperienza indimenticabile sia dal punto di vista personale che professionale.
Grazie alla mia correlatrice, la Dott.ssa Anna Pasquini, per l’aiuto nello svolgere le analisi di BAP e d-ROM.
Grazie anche alla Dott.ssa Longini dell’Azienda Ospedaliera Universitaria di Siena per la collaborazione nello svolgimento della mia tesi, e alla Dott.ssa Felici per la cortesia e disponibilità con cui mi ha spiegato le procedure di analisi dei campioni. Un grazie ai miei genitori per essersi sempre fidati del mio giudizio e avermi lasciato andare a studiare lontano da casa pur senza vederne bene il motivo.