Nello studio di questa tesi, inseminando asine con seme fresco e recuperando gli embrioni 7 giorni dopo l’ovulazione, è stato evidenziato un tasso di successo del 54,3% (12 embrioni raccolti su 22 cicli), che rientra nell’arco dei risultati riportati in bibliografia per quanto riguarda l’inseminazione artificiale con seme fresco sia dell’asina che della cavalla. Le percentuali medie di recupero di embrioni dopo inseminazione artificiale con seme fresco nella specie equina variano, infatti, dal 46% (Poitras et al., 1994) al 53% in caso di ovulazione singola fino al 106% in caso di ovulazione doppia (Squires, 1987). Altri autori riportano valori intermedi: 82% (Hochi et al., 1995); 50% (Ferreira et al,. 1997); 49,3%, 58% e 54,5% rispettivamente per embrioni di 7, 8 e 9 giorni (Fleury e Alvarenga, 1999); 87% in cavalle di 2 anni e 84,6% in cavalle adulte (Camillo et al., 2001); 50% (Squires et al., 2003); 57,6% in embrioni di 6.5 giorni (Castanheira et al., 2004); 84% (Moussa et al., 2004); 63% e 64% rispettivamente per embrioni di 6,5 e 6,75 giorni (Moussa et al., 2005); 54% in caso di ovulazioni doppie monolaterale, 64% in casi di ovulazioni doppie bilaterali (Riera et al., 2006); 63% (Mortensen et al., 2009); 81,19% (Kumar et al., 2008); 51,1% (Panzani et al.,2014). Per quanto riguarda l’asina, sempre in seguito a inseminazione artificiale con seme fresco, sono state riportate percentuali di recupero di embrioni pari al 53,3% (Allen et al., 1985); 63,6% (Vendramini et al. 1997); 67,4% (Panzani et al., 2005); 75,9% (Camillo et al., 2010); 50% (Panzani et al., 2012). Risultati così concordanti, in studi svolti in laboratori, tempi e razze di asine differenti, e non troppo distanti dai risultati che è possibile ottenere nella cavalla, confermano che l’IA con seme fresco nell’asina è una tecnica affidabile che può essere impiegata sia nella pratica clinica sia come strumento per fornire una buona base di materiale genetico,
95 embrioni, che possono essere impiegati per la ricerca o per programmi di conservazione della specie.
Per l’applicazione di questi ultimi, è necessario ricorrere alla crioconservazione degli embrioni che ne consente lo stoccaggio per un impiego differito in maniera praticamente illimitata nel tempo e nello spazio. Le tecniche di crioconservazione sono state studiate molto più diffusamente nella cavalla che nell’asina.
Nell’ambito della riproduzione equina, la preservazione degli embrioni per un tempo limitato, 24 – 48 ore alla temperatura di 5°C, consente i risultati migliori in termini di percentuali di gravidanza nelle riceventi, generalmente tra il 60 e l’80%, sovrapponibili a quelli che si possono ottenere con il trasferimento di embrioni freschi (Carnevale et al., 1987, Sertich et al., 1988, Carney et al., 1991, Moussa et al., 2003). Tuttavia la refrigerazione presenta delle limitazioni, in quanto consente la conservazione dell’embrione solo per 24-48 ore per cui è sempre necessario disporre di cavalle riceventi opportunamente sincronizzate. Le tecniche di crioconservazione vera e propria si basano, invece, sulla conservazione dell’embrione a -196°C, previo congelamento lento o vitrificazione (Araujo et al., 2005; Moussa et al., 2005; Carnevale, 2006; Eldridge-Panuska et al., 2005). Queste tecniche consentono la conservazione di embrioni per un periodo di tempo indefinito e, quindi, non implicano la disponibilità di una ricevente sincronizzata al momento dell’inseminazione della donatrice. Una delle limitazioni di queste tecniche, nel cavallo, è rappresentata dal fatto che gli embrioni debbono essere recuperati 6 giorni dopo l’ovulazione, quando hanno dimensioni inferiori ai 300 µ, e quando la percentuale di recupero è inferiore del 15-20% a quella riscontrabile ai giorni 7 e 8. D’altro canto, fino ad oggi, la vitrificazione o il congelamento di embrioni di 7 o 8 giorni, quando le dimensioni sono maggiori di 300 µ, comporta una drammatica riduzione dei tassi di gravidanza nelle riceventi che non rende applicabile questa metodica nella pratica quotidiana (Carnevale,
96 2006). Da questo punto di vista, i risultati di questa tesi testimoniano una situazione più favorevole riguardo agli embrioni di asino: al settimo giorno dopo l’ovulazione, infatti, sono stati recuperati embrioni di dimensioni inferiori ai 300 µ, quindi adatti per la crioconservazione, in 11 casi su 12, quindi in percentuale simile a quella riscontrata in caso di recupero di embrioni di età più avanzata. Questi risultati testimoniano che, nel caso di crioconservazione di embrioni di asino, non è necessario, come nel cavallo, anticipare la ricerca dell’embrione a 6 giorni dopo l’ovulazione evitando quindi la diminuzione del tasso di recupero ricollegata alla possibilità che 6 giorni dopo l’ovulazione alcuni embrioni si trovino ancora nell’ovidutto, al riparo dai tentativi di raccolta all’interno della cavità uterina. Uno dei sistemi più impiegati per la valutazione dei danni ricollegati alla crioconservazione è la colorazione con DAPI, sostanza che si lega al nucleo delle cellule morte e che permette di contarle. Ricorrendo a questa tecnica, per la valutazione di embrioni di cavallo sottoposti a congelamento lento in paillettes, sono state riportate percentuali di cellule morte mediamente del 7±2%, per embrioni giudicati vitali, e del 59±3%, per embrioni giudicati disvitali (Moussa et al., 2005); ricorrendo alla vitrificazione in open sulled straw sono state invece registrate percentuali di cellule morte del 5±2%, per embrioni vitali, e del 88±6% per embrioni disvitali (Moussa et al., 2005). Al termine di questi studi gli autori hanno definito come normali embrioni equini con < 20% di cellule morte (Moussa et al., 2005). Lo stesso tipo di valutazione su embrioni di cavallo freschi, con diametro > 300µ o <300µ, non ha registrato differenze nelle percentuali di cellule morte, rispettivamente dello 0,1% e 0,2%, mentre su embrioni sottoposti a congelamento lento, la percentuale di cellule morte era del 8,5±2,1% e del 19.0±2,9% rispettivamente per embrioni equini di diametro <300µ o >300µ (Tharasanit et al., 2005). E’ stato riscontrato il 13% di cellule marcate dal DAPI in embrioni vitrificati (Chaves et al, 1997).
97 Gli studi relativi all’applicazione delle tecniche di riproduzione assistita nell’asino sono pochi e svolti su un numero esiguo di animali. Solo recentemente sono state riportate percentuali di gravidanze accettabili dopo trasferimento di embrioni di asino subito dopo il recupero (Panzani et al., 2012) e la nascita di due asine dopo trasferimento di embrioni precedentemente vitrificati (Panzani et al., 2012). Nessuno studio, prima di questa tesi, ha preso in considerazione la valutazione della qualità degli embrioni crioconservati d’asino. Due soli lavori, svolti presso l’Università di Pisa, hanno riguardato la valutazione della qualità in embrioni di asino freschi (Panzani et al., 2012) o refrigerati (Papini M., 2012), rilevando in entrambi i casi una percentuale di cellule non vitali molto bassa, pari allo 0,9 % per embrioni freschi (Panzani et al.,2012), e allo 0,65 % per embrioni refrigerati (Papini M., 2012). I risultati di questa tesi hanno confermato l’ottima qualità degli embrioni di asino appena raccolti, solo 0,7% di cellule morte, significativamente superiore a quella degli embrioni sottoposti a vitrificazione, e valutati dopo scongelamento, nei quali la percentuale di cellule morte è stata pari al 9%. Paragonando questa percentuale a quelle riscontrate nel cavallo per embrioni crioconservati, dal 5% all’ 88% di cellule morte (Moussa et al., 2005), si evince che il danno subito dagli embrioni di asino studiati in questa tesi a causa della vitrificazione è stato limitato, rientrando nel range dei migliori risultati ottenuti nel cavallo e ben al disotto della soglia del 20% di cellule morte, definita come il limite tra embrioni vitali e non per la specie equina (Moussa et al., 2005). Questi risultati appaiono indubbiamente incoraggianti, nell’ottica di poter applicare la vitrificazione alla conservazione degli embrioni di asino, e spiegano la buona percentuale di gravidanze a 14 giorni, 4/11, ottenuta nell’unico studio reperibile in bibliografia sul trasferimento di embrioni vitrificati di asino (Panzani et al., 2012). Dato però il numero esiguo di embrioni studiati, questi risultati debbono essere
98 confermati e, soprattutto, deve essere ulteriormente verificata la percentuale di gravidanza che è possibile ottenere trasferendo nelle riceventi embrioni di asino crioconservati.
99
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