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Molti dei farmaci regolarmente apprezzati in ambiente acquatico possiedono un meccanismo d’azione in grado di generare risposte metaboliche a bassissimi dosaggi. Nel caso in cui gli organismi acquatici conservino dal punto di vista evolutivo gli stessi bersagli molecolari presenti negli organismi target, l’esposizione a concentrazioni di residui farmaceutici nell’ordine dei ng/L potrebbe produrre alterazioni fisiologiche specifiche, o generare effetti aspecifici in funzione del ruolo svolto da tali bersagli nelle specie non target (Schmitt et al., 2009; Christen et al., 2010).
Lo scopo del presente lavoro di tesi è stato quello di analizzare attraverso un approccio di tipo molecolare le possibili alterazioni fisiologiche indotte in Mytilus galloprovincialis dal meccanismo d’azione della fluoxetina, farmaco appartenente alla famiglia degli inibitori selettivi della ricaptazione presinaptica della serotonina (SSRI), ampiamente utilizzato nella terapia antidepressiva e nella cura dei disturbi alimentari. Le indagini di impatto ambientale rivelano l’ubiquitarietà e le caratteristiche di persistenza di tale composto negli ecosistemi acquatici, in cui viene frequentemente misurato a concentrazioni variabili tra i 12 ng/L, per le acque superficiali e i 540 ng/L per gli effluenti degli impianti di depurazione (Weston et al., 2001; Kolpin et al., 2002). Dal punto di vista farmacologico la fluoxetina possiede una cinetica in grado di sviluppare un’ aumento della disponibilità serotonina a livello delle fessure sinaptiche per mezzo di un meccanismo di inibizione della sua ricaptazione a livello presinaptico. Avvalendosi delle recenti acquisizioni circa la caratterizzazione del sistema serotoninergico di mitilo (Cubero-Leon et al., 2010), e sulla base delle conoscenze ormai acquisite circa le dinamiche fisiologiche che regolano le principali funzioni biologiche in questa specie (Fabbri e Capuzzo, 2010), sono stati analizzati gli effetti specifici indotti da concentrazioni di fluoxetina paragonabili al range di valori misurato in ambiente, sui target molecolari coinvolti nella risposta terapeutica al farmaco nella terapia umana. Più nel dettaglio è stato analizzato, se, e in che misura, l’esposizione per 7 giorni a dosaggi compresi tra 0.03 e 300 ng/L di FX, produca alterazioni a carico del sistema di trasduzione AMPc-dipendente, e degli endpoint molecolari ad esso correlato, in due diversi tessuti biologici, ghiandola digestiva e mantello.
Nella ghiandola digestiva l’esposizione a diverse concentrazioni di FX ha determinato una riduzione significativa dei livelli intracellulari di AMPc e dell’attività della PKA, mentre
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nel mantello non si osservano alterazioni significative dei parametri misurati, lasciando presupporre una diversa modulazione farmacologica tra i due tessuti.
La comunicazione cellulare mediata da AMP ciclico svolge un ruolo cruciale nella regolazione di numerosi processi fisiologici nei molluschi bivalvi (Fabbri e Capuzzo, 2010). La recente rivalutazione dell’importanza degli impatti ecotossicologici su tale sistema di comunicazione cellulare, si deve, in buona parte, all’aumento delle conoscenze riguardanti le sue funzioni metaboliche negli organismi acquatici e alla consapevolezza delle ripercussioni che le alterazioni collegate ad alcuni processi biologici fondamentali, come ad esempio la riproduzione, possono determinare a livello di popolazione (Fabbri e Capuzzo, 2010). Come ampiamente dimostrato, nei mitili, i livelli di AMPc sono soggetti a variazioni naturali e ad alterazioni conseguenti all’esposizione ad inquinanti di diversa natura, tra cui metalli pesanti (Dailianis et al., 2005; Fabbri e Capuzzo, 2006; Dailianis e Kolayianni, 2007), sottoprodotti organici di origine industriale (Raftopoulou et al., 2006), biotossine algali (Buratti et al., 2010) e prodotti farmaceutici (Martin-Diaz et al, 2009; Franzellitti et al., 2011). Il sistema di trasduzione AMPc-dipendente è innescato dall’interazione tra diversi gruppi di ligandi extracellulari di natura peptidica, tra cui adrenalina, noradrenalina e 5HT, e una larga famiglia di recettori associati a proteine G (GPCR). Nei mammiferi sono state caratterizzate 7 tipologie di recettori per la serotonina (5HT1-7). Le classi 5HT1,2 e 5HT4-7 fanno parte della superfamiglia dei recettori accoppiati a proteine G (GPCR, G-protein coupled receptor). Il recettore 5HT3 è invece un recettore ionotropico (Hoyer et al., 2002). Nei mitili l’unico recettore della serotonina sinora riconosciuto e sequenziato è il 5HTmyt1, il quale presenta un’elevata omologia strutturale con il sottotipo 5HT1 dei mammiferi (Cubero-leon et al., 2010). Si tratta di un recettore accoppiato ad una proteina Gi responsabile dell’ inibizione dell’enzima adenilil ciclasi a cui corrisponde una riduzione della concentrazione cellulare di AMPc e dell’attività di enzimi e prodotti di trascrizione ad esso correlati (Hannon e Hoyer, 2008).
La riduzione dei livelli di AMPc/PKA osservata nella ghiandola digestiva definisce in maniera chiara la presenza dei bersagli cellulari su cui la FX esercita i propri effetti nella terapia umana in M. galloprovincialis. In particolare, si osserva che attraverso l’inibizione del reuptake presinaptico della 5HT, la FX determina un aumento della concentrazione del neurotrasmettitore a livello della fessura sinaptica a cui corrisponde una maggiore
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attivazione dei recettori 5HTmyt1 e, di conseguenza, un aumento dell’effetto inibitorio sul sistema di trasduzione AMPc-dipendente. Tali risultati si discostano in maniera rilevante da quanto precedentemente riportato da Garnerot e coll. (2006), i quali descrivono un’apparente assenza di fibre nervose serotoninergiche all’interno della ghiandola digestiva dei molluschi bivalvi. In compenso essi risultano in accordo con i risultati ottenuti in un precedente lavoro di tesi effettuato su M. galloprovinciaslis (tesi di LMBM, I. Tosarelli, 2012).
Da quanto si evince dai nostri dati, i due tessuti rispondono in maniera differente all’azione della fluoxetina, verosimilmente in relazione ai noti processi fisiologici che si verificano nel mantello in funzione dello stadio di maturazione sessuale dei mitili. A tal proposito occorre tener presente che il prelievo dei mitili utilizzati nel test è stato effettuato nel mese di maggio, che corrisponde, stando alle attuali conoscenze, al periodo dell’ anno in cui si verifica l’ultima fase di maturazione sessuale prima dello spawning (Gabbott et al., 1983; De Zwaan et al., 1992; Villalba et al., 1995). L’ accesa colorazione del mantello osservata durante il prelievo dei tessuti, ha fornito a tutti gli effetti un’ulteriore conferma dell’avanzato stadio gametogenico degli individui campionati. Analizzando nel dettaglio i dati relativi alle variazioni dell’attività della PKA, si osserva che nel mantello La FX determina un’effettiva inibizione dose-dipendente fino a 0,3 ng/L, a cui corrisponde una riduzione significativa dell’attività dell’enzima, mentre alle concentrazioni maggiori gli effetti del farmaco sembrano diminuire in maniera proporzionata all’aumento delle dosi somministrate. Al contrario, nella ghiandola digestiva, pur essendo effettivamente riconoscibile tale andamento, gli effetti della FX sull’attività dell’enzima risultano significativi anche alle più alte concentrazioni. In accordo con i nostri dati, diversi test ecotossicologici condotti su organismi acquatici al fine di valutare gli effetti di farmaci SSRI sui processi legati alla riproduzione, rivelano frequenti alterazioni a dosaggi medio- bassi ed effetti blandi o assenti a concentrazioni maggiori (Schmitt et al., 2009). Simili risposte sono oltretutto ancor più marcate nei test aventi come oggetto di studio le alterazioni del ciclo riproduttivo indotte dalla FX negli invertebrati acquatici, tra cui crostacei e molluschi (De lange et al., 2006; Sanchez-Arguello et al., 2009; Gust et al., 2009). Fong e coll. (2003) hanno a tal proposito ipotizzato che a concentrazioni molto elevate, la FX possa fungere da antagonista dei recettori serotoninergici determinando la diminuzione degli effetti specifici che vengono così rappresentati da un particolare
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andamento ad U (U-shaped curve), tipicamente osservato nelle curve dose-risposta dei ligandi recettoriali. I nostri dati mostrano inoltre un livello di attività basale della PKA circa 1.5 volte maggiore nel mantello rispetto alla ghiandola digestiva e tali differenze risultano confermate in studi precedenti effettuati su mitilo (Martin-Diaz et al.., 2009; Franzellitti et al., 2011) a conferma della diversa funzione modulatoria assunta dal sistema di trasduzione AMPc–dipendente nei due tessuti. A tal proposito, precise indicazioni sono fornite dalla differente distribuzione tissutale delle due isoforme della PKA (PKAmyt1 e PKAmyt2) precedentemente isolate e caratterizzate nel mitilo mediterraneo sulla base di differenti propietà biochimiche, chimico-fisiche ed immunogeniche (Bardales et al., 2004). La PKAmyt1 risulta l’unica isoforma presente nella ghiandola digestiva, mentre entrambi i tipi sono stati riconosciuti all’interno del mantello (Bardales et al., 2009, 2011), in cui risulta peraltro documentata una regolazione significativa dell’attività della PKAmyt2 in funzione della temperatura che, di riflesso, ne suggerisce un ruolo associato alle fasi stagionali del ciclo riproduttivo (Bardales et al., 2004, 2009).
L’apparente assenza di effetti specifici osservata nel mantello può essere dunque interpretata come una conseguenza dell’ interazione tra diversi processi fisiologici operanti attraverso il sistema di trasduzione AMPc dipendente, fenomeno precedentemente documentato nel mantello di altri molluschi bivalvi (Matsutani e Nomura, 1986).
Nei mitili, il mantello rappresenta il principale serbatoio di riserve energetiche per i processi fisiologici responsabili della gametogenesi e dello spawning (Lubet, 1957), e al suo interno sono state documentate variazioni stagionali dei livelli di AMPc, e del suo effettore AC, strettamente correlate allo stadio di maturazione sessuale e al sesso degli animali (Mancebo et al., 1991, 1992, Blanco et al., 2005). Come ampiamente dimostrato, la 5HT svolge una funzione neuromodulatoria determinante nei processi di maturazione e rilascio dei gameti che avvengono nel tessuto gonadico, il quale si presenta come una massa ghiandolare scarsamente differenziata all’interno del mantello (Gibbons e Castagna, 1984; Osanai, 1985; Fong e Warner, 1995, Fong, 1998, Garnerot et al., 2006). Tuttavia, sulla base dei dati disponibili in letteratura, l’attività degli enzimi responsabili dei processi glicolitici e glicogenolitici che si verificano ai fini del processo di maturazione delle gonadi nel mantello dei molluschi bivalvi, è regolata prevalentemente dall’azione delle catecolamine, in particolare noradrenalina e dopamina, il cui meccanismo d’azione determina un innalzamento dei livelli intracellulari di AMPc attraverso un’attivazione dei
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recettori β-adrenergici. (Osadaa et al., 1987; Osada e Nomura, 1989; Vazquez-Illanez et al., 1991; Fernandez et al., 1994, 1997; Cao et al., 1995; Martinez et al., 1996; Diaz- Enrich e Ibarguren, 2002; Barth et al., 2007; Lopez-Sanchez et al., 2009). Essendo stata già documentata l’esistenza di uno stretto legame tra la comunicazione cellulare catecolaminergica e serotoninergica nelle dinamiche fisiologiche che regolano il ciclo riproduttivo dei molluschi bivalvi (Matsutani e Nomura, 1986), non è azzardato ipotizzare che nel mantello di mitilo gli effetti specifici della FX siano stati influenzati in maniera considerevole dalla regolazione AMPc-dipendente dei processi fisiologici associati ai fenomeni glicolitici e glicogenolitici. Inoltre va sottolineato che evidenti fenomeni di cross-talk tra il sistema nervoso serotoninergico e quello noradrenergico, sono già stati precedentemente osservati nello studio degli effetti modulatori dei farmaci in M. galloprovincialis (Tesi LMBM Ilaria Tosarelli, 2012), oltre ad essere stati precedentemente descritti nella terapia antidepressiva umana caratterizzata dall’assunzione di SSRI (Blier, 2001). Inoltre va sottolineato che nei mitili pur essendo stato isolato e sequenziato esclusivamente il recettore 5HTmyt1, a cui corrisponde un inibizione della via di trasduzione AMPc-dipendente, esistono chiare evidenze della presenza di ulteriori recettori serotoninergici associati all’aumento dell’attività dell’ adenilil ciclasi nelle branchie di mitilo (Fabbri e Capuzzo, 2006). Pertanto non si può escludere che nel mantello i livelli di AMPc e l’attività della PKA siano modulati da tipologie di recettori serotoninergici ad oggi ancora non riconosciute.
Uno dei molteplici aspetti non ancora approfonditi circa le alterazioni di carattere fisiologico indotte dai farmaci negli organismi acquatici riguarda i possibili effetti che essi determinano sulla modulazione dell’espressione genica dei recettori coinvolti nella trasduzione del segnale chimico cellulare. Come detto in precedenza, la fluoxetina inibendo il fenomeno di ricaptazione, determina l’aumento delle concentrazioni extracellulari della serotonina (5HT), che induce i vari effetti biologici ad essa correlati. A sua volta, nei mammiferi, il neurotrasmettitore endogeno 5HT è in grado di regolare l’espressione dei propri recettori. In ragione di ciò, parte del presente lavoro di tesi è stato a valutare se la FX a concentrazioni ambientali sia in grado di influenzare, pur indirettamente, i livelli di espressione del gene codificante per il recettore 5HTmyt1. Sia nel mantello che nella ghiandola digestiva si nota un aumento dell’espressione genica di
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5HTmyt1 alle minori concentrazioni, mentre ai dosaggi più alti i livelli di espressione genica non subiscono alterazioni significative. Ciò dimostra che l’aumento delle concentrazioni extracellulari di 5HT, indotto dalla FX, determina un’effettiva regolazione dell’espressione genica del recettore 5HTmyt1, meccanismo peraltro già documentato nei mammiferi, in cui l’espressione di diverse classi di recettori di membrana risulta regolata in modo retroattivo dall’attività dei rispettivi ligandi endogeni (Collins et al.,1992; Johnston et al., 1993). Verosimilmente, Il netto calo dell’espressione genica apprezzato a dosaggi maggiori potrebbe essere determinato da un controllo a feedback negativo generato da condizioni di concentrazioni extracellulari di serotonina troppo elevate. Inoltre ciò si ricollega all’ipotesi di Fong e coll. (2003) precedentemente descritta circa la possibilità che ad alti dosaggi, la FX possa fungere da antagonista del recettore 5HTmyt1, come già precedentemente documentato in studi condotti su mammiferi (Ni e Miledi, 1997).
Le informazioni riguardanti la regolazione dei meccanismi di trasduzione del segnale chimico in funzione della disponibilità di recettori sono attualmente molto frammentate per i molluschi bivalvi. Nella ghiandola digestiva le alterazioni indotte dalla FX a carico dell’espressione genica recettoriale determinano un’effettiva inibizione del meccanismo di trasduzione AMPc-dipendente, mentre nel mantello, ad una simile regolazione dell’espressione recettoriale corrisponde un innalzamento dei livelli intracellulari di AMP- ciclico. Essendo nota la funzione inibitoria del recettore 5HTmyt1 sui meccanismi di trasduzione del segnale AMPc-dipendente, tali dati non forniscono informazioni precise in merito ad una possibile relazione causa-effetto tra le alterazioni dell’espressione genica del recettore e i livelli intracellulari di AMPc, ma piuttosto rappresentano un’ulteriore conferma all’ipotesi precedentemente formulata circa l’influenza all’interno del mantello di dinamiche fisiologiche regolate da sistemi di comunicazione neuroendocrina differenti da quello serotoninergico nella valutazione degli effetti della FX sul sistema di trasduzione del segnale AMPc dipendente.
Un possibile bersaglio del meccanismo d’azione della FX negli organismi acquatici è rappresentato dal sistema di detossificazione cellulare noto come Multi-Xenobiotic Resistance (MXR). Esso rappresenta un meccanismo di estrusione di molecole estranee al metabolismo cellulare ad opera di specifici trasportatori di membrana appartenenti alla
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classe delle ATP-binding cassette (ABC). Tra questi la P-glicoproteina (Pgp) risulta essere una delle molecole maggiormente coinvolte nel sistema MXR nei molluschi bivalvi. Il coinvolgimento del sistema di trasduzione AMPc dipendente nella regolazione di tale linea di difesa nell’uomo (conosciuto come MDR, Multi-Drug Resistance) fu stabilito diversi anni fa da Rohlff e Glazer (1995), e un’ ipotesi concernente una simile regolazione negli invertebrati fu in seguito ipotizzata da Bard (2000). A tale scopo i due tessuti campionati sono stati sottoposti ad un’analisi dell’espressione del gene ABCB1, codificante per la MgPgp di mitilo. Nella ghiandola digestiva è stato possibile osservare una sottoespressione del gene ABCB1, statisticamente in linea con i valori relativi alle concentrazioni di AMPc e all’attività della PKA. Nel mantello si osserva invece una diminuzione significativa dei livelli di trascrizione genica nei trattamenti a concentrazioni intermedie, a cui però non corrispondono alterazioni significative dei parametri succitati. I risultati ottenuti per quest’ultimo tessuto sono in netta controtendenza con i dati ricavati da precedenti studi condotti su mitilo, in cui era stato possibile evidenziare una significativa correlazione tra le variazioni di AMPc/PKA e l’espressione genica delle proteine responsabili del sistema MXR, suggerendo una possibile regolazione AMPc-dipendente per tale meccanismo di difesa (Martin-Diaz et al., 2009 Franzellitti et al., 2011). Tuttavia, uno studio riguardante gli effetti della yessotossina su determinati endpoint biologici nei mitili dell’adriatico settentrionale rivela una correlazione negativa tra le concentrazioni intracellulari di cAMP e l’espressione genica di MgPgp (Buratti et al., 2010). Ciò lascia ipotizzare l’esistenza di ulteriori dinamiche fisiologiche non ancora ben evidenziate in grado di influenzare significativamente la regolazione del sistema MXR in M. galloprovincialis. Nell’uomo è stata ampiamente confermata un’evidente correlazione tra i livelli di trascrizione del gene ABCB1 e condizioni di stress ossidativo.(Lenehan et al., 1995; Hong et al., 2006; Lu et al., 2011). In parallelo con le analisi effettuate ai fini del presente lavoro di tesi, ulteriori indagini portate avanti dallo stesso laboratorio di biochimica e fisiologia ambientale del CIRSA, hanno valutato gli effetti tossici della FX per i diversi trattamenti effettuati attraverso l’utilizzo di una batteria di biomarker. Ciò che emerge è che nella ghiandola digestiva, le concentrazioni di FX che determinano una riduzione dell’espressione del gene ABCB1 producono al contempo una sostanziale attivazione degli enzimi antiossidanti glutatione S-transferasi (GST) e/o catalasi (CAT) (Tesi di LMAGA, Alessandro Mola, 2012) in accordo con quanto precedentemente osservato da Buratti e coll. (2010). Pur non
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essendo stati analizzati i marcatori di stress ossidativo nel mantello, l’ipotesi che possa essersi verificato un simile trend è supportata dai dati ottenuti in studi precedenti che confermano un andamento inverso tra l’ attività degli enzimi antiossidanti e i livelli di espressione genica di MgPgp nel mantello di mitili esposti a concentrazioni ambientali di farmaci (Martin-Diaz et al., 2009; Franzellitti et al.,2011). I dati discussi in questa tesi dimostrano quindi che la trascrizione delle proteine responsabili del sistema di difesa MXR nei mitili è influenzata in maniera rilevante dalle alterazioni prodotte sia a livello molecolare che cellulare dalla FX, determinando un aumento della suscettibilità dei mitili ai pericoli derivanti dall’assorbimento di sostanze tossiche.
Nel loro insieme, i risultati ottenuti dimostrano che l’esposizione sub-cronica a concentrazioni di fluoxetina comprese nell’intervallo di valori comunemente misurati in ambiente determina nei mitili significative alterazioni di parametri della trasduzione del segnale e della trascrizione genica. Tali evidenze delineano un profilo di tossicità in netta controtendenza con le informazioni estrapolate dagli studi di tossicità acuta e confermano la capacità da parte di molecole biologicamente attive di produrre effetti specifici negli organismi acquatici anche a concentrazioni fino ad oggi+ considerate irrilevanti dal punto di vista ecotossicologico.
Gli effetti registrati sui parametri correlati al sistema di trasduzione AMPc dipendente rivelano che nei mitili il meccanismo d’azione della fluoxetina determina una modulazione specifica dei medesimi bersagli molecolari coinvolti nella terapia umana, i quali risultano pertanto evidentemente conservati nel corso dell’evoluzione. Tale analisi ha consentito di effettuare delle prime importanti considerazioni circa i fenomeni fisiologici coinvolti nella modulazione dell’output riproduttivo, fenomeno notoriamente indotto dalla fluoxetina somministrata a varie specie di organismi acquatici nelle pratiche di acquacoltura; ciò fornisce al contempo utili acquisizioni circa gli effetti specifici e aspecifici del farmaco in funzione del ruolo rivestito dal sistema nervoso serotoninergico nei diversi tessuti biologici analizzati.
L’esposizione al farmaco ha inoltre determinato l’inibizione del sistema di detossificazione MXR, deputato all’escrezione cellulare di sostanze xenobiotiche. Tale effetto comporta un aumento della vulnerabilità dei mitili alle alterazioni prodotte da sostanze estranee al
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metabolismo cellulare e pone l’accento sulla possibile comparsa di fenomeni di tossicità sinergica con altre sostanze disciolte in ambiente acquatico.
Infine, l’analisi dell’espressione genica del recettore 5HTmyt1 ha permesso di identificare un meccanismo di regolazione della sintesi recettoriale in funzione delle concentrazioni extracellulari di serotonina e ha dimostrato la presenza di fenomeni di inibizione della trascrizione genica a dosaggi di farmaco più elevati.
Nei mitili, quindi, la fluoxetina è in grado di indurre l’alterazione di diversi parametri fisiologici a concentrazioni inferiori al limite di 10 ng/L previsto dalle linee guida dell’EMEA. Tale assunto dimostra la validità delle indagini tossicologiche mediante approccio molecolare come strumento indispensabile per una corretta valutazione dei rischi legati alla presenza di composti dal meccanismo d’azione specifico in ambiente acquatico, anche ai fini della formulazione di farmaci dal minor impatto ecotossicologico. Tuttavia occorre precisare che le risposte a livello molecolare non sono state in grado di identificare chiare relazioni dose-dipendenti nella variazione dei parametri analizzati. Inoltre non chiariscono sufficientemente le ripercussioni che gli effetti osservati determinano a livello ecosistemico.
In conclusione, il presente lavoro di tesi ha fornito nuove conoscenze circa gli effetti cellulari/molecolari indotti da concentrazioni ambientali di fluoxetina nel mitilo mediterraneo. Inoltre ha fornito importanti approfondimenti inerenti la fisiologia del mitilo, correlati al meccanismo d’azione della serotonina. In entrambi i casi, tali contributi sono utilizzabili come base conoscitiva in vista di futuri approfondimenti, in ambito fisiologico ed ecologico
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