L'infezione da HEV è una frequente causa di epatiti sporadiche in paesi emergenti dove si sono riscontrate vere e proprie epidemie in seguito a contaminazione di acque con materiale fecale infetto (Emerson & Purcell, 2003; Guthmann et al., 2006; Panda et al., 2007; Purcell & Emerson 2008; Aggarwal 2011). Nei paesi sviluppati l'infezione è presente in persone che hanno effettuato viaggi in zone endemiche ma in periodi recenti il numero di casi autoctoni è sensibilmente aumentato (Fauquet et al., 2007; Lewis et
al., 2010; Slot et al., 2013; Hogema et al., 2014; Dalton et al., 2014). Tecniche molecolari altamente sensibili per l'identificazione del genoma
virale hanno contribuito ad aumentare il tasso di rilevamento di HEV in suini, ma la scarsa resistenza del virus nelle feci rappresenta un limite importante per rilevarne la presenza. La diagnosi sierologica per mezzo di test immunologici può rappresentare quindi un valido metodo di screening perché gli anticorpi specifici anti-HEV rimangono rilevabili molto più a lungo rispetto all’RNA virale.
La valutazione della presenza di anticorpi specifici anti-HEV viene di solito eseguita utilizzando kit commerciali che impiegano la proteina capsidica ORF-2 di HEV umano come antigene. Nonostante le possibili cross-reazioni tra i vari genotipi in virtù delle differenze minime riscontrate tra proteine ORF2 di origine umana e suina (Arankalle, 2007), è stato evidenziato il raggiungimento di una maggiore specificità e sensibilità attraverso l’utilizzo di un antigene specie specifico (de Oya et al., 2009).
Recenti studi hanno dimostrato che l’impiego di un antigene specifico di genotipo 3 di derivazione suina consente un incremento della sensibilità
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del test (Peralta et al., 2009; Rose et al., 2010, Ponterio et al., 2014). Pertanto, nel presente studio, un frammento ricombinante della glicoproteina capsidica ORF-2 di un ceppo italiano di HEV genotipo 3, isolata dal suino, è stato utilizzato come antigene per il riconoscimento di anticorpi anti-HEV in sieri raccolti da allevamenti industriali attraverso l’allestimento di un test ELISA indiretto. Tali sieri erano stati precedentemente individuati come positivi o negativi attraverso l’applicazione del kit HEV Dia.Pro. La proteina virale ottenuta tramite la tecnologia del baculovirus ricombinante è stata sottoposta a purificazione al fine di ottenere un antigene da applicare in un test ELISA indiretto. Dai dati ottenuti si evidenzia che la purificazione della proteina in condizioni non denaturanti risulta più efficiente. Tali condizioni hanno permesso di ottenere una miglior performance finale del test ELISA rispetto alle condizioni denaturanti. Una possibile spiegazione può essere data dal fatto che la presenza della coda di Istidina è maggiormente disponibile al legame con la resina di nichel impiegata nella colonnina di purificazione. Inoltre la maggior antigenicità in condizioni native può essere attribuita a una miglior esposizione dell'epitopo antigenico.
Dal momento che nell’allestimento di un test ELISA indiretto il coating riveste un ruolo fondamentale sia per la reattività che per la riproducibilità dei risultati sono stati presi in considerazione diversi fattori in grado di modulare l’efficienza di legame dell’antigene sulla piastra ed in particolare il tempo e la temperatura di incubazione. Sono state effettuate prove di incubazione scegliendo tre diverse temperature facilmente riproducibili anche in assenza di particolari strumentazioni: 4°C (refrigerazione), 20- 25°C (temperatura ambiente standard) e 37°C. Dal momento che sia l’incubazione a temperatura ambiente che quella a 37°C hanno mostrato
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una buona efficienza di adsorbimento per il protocollo finale è stata selezionata la modalità a 25°C per semplificarne l’esecuzione.
Un secondo aspetto da valutare nello sviluppo di un test ELISA per la diagnostica sierologica è rappresentato dalla specificità di reazione antigene-anticorpo. Fattori che possono interferire con la reazione sono dati sia dalla presenza di sostanze in grado destabilizzare il legame antigene-anticorpo sia alla co-presenza di immunoglobuline responsabili della comparsa di false positività e reazioni aspecifiche. Al fine di ridurre cross-reazioni sono state effettuate prove di diluizione in soluzioni contenenti reagenti saturanti a concentrazioni diverse (skimmed milk 5% e BSA 1%). I risultati migliori sono stati ottenuti utilizzando il Blocking Buffer 3 contenente BSA alla diluizione 1:50. Per il riconoscimento del legame antigene-anticorpo in considerazione della anomala reattività della proteina A e della proteina G inizialmente considerate come possibili candidati la selezione è stata spostata su anticorpi specifici (Goat anti-pig). Al fine di ridurre il background di reazione nel protocollo definitivo l’anticorpo secondario è stato settato al maggior punto di diluizione (1:200). Sulla base delle positività riscontrate dall’applicazione del kit HEV Dia.Pro su un pannello di sieri positivi o negativi, la soglia cut off è stata calcolata volta per volta portando in un primo momento l’intervallo di confidenza da due a tre deviazioni standard come riportato in numerosi lavori di diagnostica ELISA (Woo et al., 2001; Singh 2006; Nybo 2010; Ting
et al., 2014); successivamente al fine di migliorare il potere discriminante
del test è stata valutata la possibilità di utilizzare la percentuale di positività (PP) riportata da Tittarelli et al., 2011 come indice discriminatorio che considera per il calcolo del valore soglia sia la media OD dei controlli positivi sia la media OD dei controlli negativi.
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Da quanto è emerso nei risultati sia il limite inferiore calcolato al 99% di confidenza sia l’indice PP consentono una discriminazione corretta dei campioni di controllo positivi e negativi.
In conclusione l'impiego di una proteina ORF-2 derivata da un ceppo virale di origine suina recentemente circolante in Italia ha in effetti permesso di ottenere un antigene in grado di reagire efficacemente con i sieri che sono stati utilizzati nel nostro studio. In questo lavoro è stato sviluppato un protocollo per la purificazione della proteina ORF-2 HEV e per il suo utilizzo come antigene in un test ELISA indiretto.
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APPENDICE
Reagenti utilizzati nel protocollo definitivo:
• Buffer di Coating 50 mM (3,03 g Na2CO3 , 6 g NaHCO3 in 1 l di H2O,
pH = 9,6);
• Blocking Buffer 3 (PBS 1X, Tween 20 0,05%, bovine serum albumin 1%(BSA );
• Buffer di lavaggio (PBS 1X, Tween 0,05%).
TEST ELISA FINALE HEV PROTEINA ORF-2
1. Coating antigenico: 0,25µg/ml, 100µl pozzetto; incubazione over night a temperatura ambiente (25°C)
2. Ciclo di 4 lavaggi con Buffer di Lavaggio (300μl per pozzetto) ad intervalli di 3 minuti tra un lavaggio e l'altro;
3. Dispensazione dei sieri in test: diluizione 1:50 in blocking buffer 3 (100 μl per pozzetto)
4. Incubazione 1h a 37°C
5. Ripetizione del ciclo di lavaggi di cui al punto 2;
6. Dispensazione anticorpo secondario: Anti-suino IgG HRP coniugato diluito 1:200 in Blocking Buffer 3 (100 μl per pozzetto)
7. Incubazione 1 h a 37°C
8. Ripetizione ciclo di lavaggi di cui al punto 2
9. Sviluppo: 100 μl di ABTS + H202 30% (diluizione 1:1000) in ciascun
pozzetto
10. Incubazione al buio per 5-20 minuti a temperatura ambiente 11. Lettura OD: 405 nm
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Cut off (CO):
• calcolo del limite inferiore con un intervallo di confidenza al 99% attraverso l’applicazione della seguente formula µODneg + 2,58 * dev. St (IC 99%);
• calcolo della percentuale di positività (PP) attraverso l’applicazione della formula proposta da Tittarelli et al., 2011 (OD campione in test - µODneg/ µODpos - µODneg ) * 100; sono stati considerati positivi i campioni con reattività ≥ 50%, dubbi i campioni con reattività compresa tra 40% e 50% e negativi i campioni con valori ≤ 40%.
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