4.25) SUBSTRATO TB KCl 0.25 M
6) DISCUSSIONE E PROSPETTIVE
Le prime fasi (ligazione di pCB0533, pCB0534, pCB0535 con pCB1399; trasformazione di A. tumefaciens) di questo esperimento sono state abbastanza buone (vedere i risultati), la frequenza totale di trasformazione è stata piuttosto alta (66.67%).
La kanamicina ha ucciso i controlli negativi, quindi potremmo pensare che per un espianto di lattuga è impossibile sopravvivere, senza l'inserto genetico, nei substrati con questo antibiotico (e fra l'altro anche con una concentrazione piuttosto alta, 100 mg/l), o almeno senza il gene nptII che ne conferisce la resistenza, ma sembra che molte piante non trasformate siano sopravvissute, probabilmente perchè alcune loro cellule contenevano il T-DNA e altre no (piante chimeriche), e quindi abbiamo analizzato vegetali che pur non contenendo i transgeni nelle cellule analizzate lo contenevano in altre, è possibile che in questi espianti chimerici le cellule trasformate hanno prodotto bassi quantitativi di neomicina transferasi II, ma sufficienti a permettere la (stentata) sopravvivenza degli espianti, comunque gli espianti che sono risultati negativi per entrambi gli amplificati alla “tissue” PCR avevano un aspetto molto provato (molto clorotici, quasi morti), invece di solito i germogli che sono risultati positivi alla trasformazione avevano un aspetto abbastanza buono e vitale, segno di una buona espressione del gene nptII.
Avremmo potuto aumentare la concentrazione di kanamicina, ma così facendo avremmo corso il rischio di uccidere anche piante trasformate, ma con una bassa espressione del gene nptII, fra l'altro data l'alta aberrazione della trasformazione degli espianti, non è detto che ad un'alta produzione della proteina neomicina fosfotransferasi II corrisponda un'elevata espressione del gene fuso HPV16 E7GGG- GUS.
risultati della tissue PCR, il Southern Blot chiarirà meglio questi dubbi), i quali contengono o il transgene nptII o E7, come già riportato il primo è risultato più comune (rispettivamente il 60.32 e 46.83%).
Effettivamente a volte è inserita soltanto una parte del T-DNA, e altre possono essere mancanti.
E' risaputo che l'inserzione di T-DNA causa riarrangiamenti (Gheysen et al. 1987), delezioni e inserzioni, integrazioni invertite e in tandem (Bundock et al. 2002 e De Buck et al. 1999), quindi questi cambi nel genoma possono causare inserzioni non complete di T-DNA.
In pioppo è stato visto che nei bordi destri e sinistri erano presenti delezioni di 2-23 bp, invece nei siti d'inserzione del T-DNA nel genoma di pioppo sono state trovate da poche paia fino a 570 paia di basi mancanti (Kumar et al. 2002), queste delezioni, se avvengono in un punto di appaiamento dei primer, possono provocare mancate rilevazioni di transgeni tramite la PCR.
Le inserzioni in cui le estremità del T-DNA causano dei cambiamenti sia al DNA inserito che nel genoma della pianta vengono chiamate “inserzioni imprecise” (Meyerhofer et al. 1991), queste inserzioni sono caratterizzate dalla presenza di “filler DNA” fra l'inserto e il genoma della cellula ospite di circa 2-200 bp, questo DNA dovrebbe provenire sia dal materiale genetico della pianta che da quello del T- DNA (Kumar et al. 1992), causando in quest'ultimo caso le suddette delezioni.
Anche mutazioni nei geni vir possono causare inserzioni di T-DNA non complete, per esempio in Aspergillus awamori trasformati(la trasformazione mediata da A.
tumefaciens è abbastanza simile fra i vegetali e i funghi) con agrobatteri con virE2
mutato, avevano troncamenti nelle zone vicino all'LB, invece gli A. awamori trasformati con A. tumefaciens con virD2 mutato avevano delezioni in prossimità dell'RB (Michielse et al. 2004).
Infatti VirD2 si lega all'RB, inserendo prima questa estremità e poi il resto del T- DNA (Zupan et al. 1995), quindi le parti vicine al bordo destro dovrebbero essere più comuni, ed effettivamente nel nostro caso l'amplificato di nptII è stato più comune di
quello di E7 (rispettivamente 60.32% e 46.83%), il quale è situato più lontano dall'RB.
In contrasto con Torres (Torres et al. 1993, vedere il paragrafo 1.7.2), abbiamo ottenuto lattughe trasgeniche da cotiledoni excisi da piantine di 7 giorni di età, probabilmente questo è stato causato dalla buona suscettibilità della varietà Ach'at alla trasformazione e alla rigenerazione, questa differenza di frequenza di ottenimento di espianti trasformati potrebbe essere causata a differenze della membrana cellulare (per esempio la relativa recalcitranza delle monocotiledoni alla trasformazione mediata dall'Agrobatterio è dovuta a differenze nella membrana cellulare), forse l'aumento dello spessore di questa potrebbe ostacolare la penetrazione batterica, questo potrebbe anche spiegare la non perfetta trasformazione di alcuni espianti. A volte anche cicli termici di PCR non corretti possono dare erronei risultati, ma lo escludiamo perchè le prove con i controlli positivi (colonie trasformate di A.
tumefaciens) e negativi (solo master mix)erano perfette.
Purtroppo l'attività GUS non è stata particolarmente alta, probabilmente questo è dovuto a un parziale silenziamento del transgene, o a copie multiple di T-DNA inserite, quindi il Southern Blot eliminerà questo dubbio.
I substrati usati e la trasformazione non hanno dannegiato le piante, in quanto il loro aspetto esteriore e la loro produzione di proteine totali è stata di solito abbastanza buona.
Sapevamo che il sito ATG di E7 per l' inizio di traduzione dei ribosomi non era molto buono, e che questo avrebbe potuto causare una minore espressione del transgene, ma comunque abbiamo anche ottenuto una buona produzione di transproteine da alcuni espianti, inducendoci a pensare che non è stata questa la causa principale della bassa attività GUS di molte piante.
Le piante con il costrutto genico 97 avevano di solito l'aspetto più provato, a tal punto che abbiamo ritenuto inutile eseguire la misurazione dell'attività GUS, e in teoria queste piante dovrebbero avere (per il differente codon bias usato) la minore espressione del gene E7, anche se questo non necessariamente significa una minore
espressione di nptII.
Abbiamo anche notato che a volte il segnale del MU (vedere il paragrafo 3.7) al tempo 0, questo potrebbe essere causato da 4-metilumbelliferone pre-idrolizzato (Jefferson. 1987).
E' anche necessario verificare se la proteina fusa HPV16 E7GGG-GUS ha causato cambi conformazionali alla proteina virale, che potrebbero dare epitopi con struttura tridimensionale diversa rispetto a quella selvatica, il che potrebbe stimolare risposte immunitarie non efficienti nel guarire le infezione di HPV16.
Le lattughe ottenute saranno anche riprodotte sessualmente per monitorare l'eredità dell'inserto genetico, è stato visto che la trasmissione genetica dei transgeni nelle varie generazioni è di tipo Mendeliano, e che i geni marker (come quelli che conferiscono resistenza contro gli antibiotici) sono dominanti nelle piante eterozigoti (De Block et al. 1984), aspettiamo lo stesso comportamento anche per il transgene HPV16 E7GGG-GUS.
I futuri esperimenti su topi dimostreranno se l'immunogenicità di questa transproteina è efficiente nel guarire le infezione da HPV16.
Comunque è importante continuare questi esperimenti, apportando eventualmente delle modifiche (per esempio con diversi costrutti genetici, con differenti codon bias, con cotiledoni di diverse età, con diversi substrati, trasformazione dei plastidi ecc...). Comunque abbiamo ottenuto lattughe con la proteina fusa HPV16 E7GGG-GUS, e quindi pensiamo che questi esperimenti sono stati buoni, e che sono stati degli “step” riusciti per lo sviluppo di vaccini terapeutici vegetali contro le infezioni del papilloma virus umano del tipo 16.
RINGRAZIAMENTI
Vorrei ringraziare tutte le persone che mi hanno aiutato in questa meravigliosa esperienza professionale e di vita, in particolare i seguenti professori: Marco Nuti, Lorenzo Guglielminetti, Claudio Pugliesi (Università di Pisa), Jindrich Břìza, Joseph Vlasàk, Hana Niedermejerovà (Università del Sud Boemia, e centro biologico dell'Accademia delle Scienze della Repubblica Ceca), e tutti al dipartimento di Manipolazione Genetica dell'Accademia delle Scienze della Repubblica Ceca nella sede di České Budĕjovice.
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