RISULTATI E DISCUSSIONE
Attualmente, le analisi cliniche e patologiche utilizzate nella diagnosi del carcinoma della tiroide sono insufficienti per comprendere il comportamento del tumore, e nuovi markers prognostici e diagnostici devono essere identificati.
L‟analisi corretta di carcinomi tiroidei può essere spesso difficile in quanto i diversi sottotipi di carcinoma hanno un‟architettura follicolare simile, che risulta difficile da distinguere usando gli strumenti di analisi tradizionali.[2] Ciò è particolarmente vero in presenza di noduli che presentino un quadro citologico di proliferazione follicolare, per i quali si è costretti ad eseguire un intervento chirurgico di tiroidectomia per poter fare la diagnosi definitiva.
I progressi nella scoperta di biomarkers tiroidei hanno portato all‟identificazione di varie proteine attraverso l‟espressione genica e l‟analisi immunoistochimica.[35,36]
Recentemente, un più utile e promettente approccio è quello di cercare biomarkers non solo a livello genico, ma anche a livello proteico tramite tecniche di proteomica. Questi studi sono stati condotti principalmente su cellule, su tessuti tiroidei come carcinomi papillari e follicolari [37,38,39] e su noduli tiroidei freddi.
In uno studio precedente, condotto presso il nostro laboratorio, è stata determinata, per la prima volta, l‟analisi del proteoma dell‟ago-aspirato della tiroide umana. Questo studio ha previsto l‟inclusione di 400 campioni di ago aspirato tiroideo, con diversa classificazione citologica ed istologica. Combinando l‟elettroforesi bidimensionale con la spettrometria di massa MALDI-TOF abbiamo quindi confrontato le immagini ottenute dai noduli benigni con quelli maligni. Tra le proteine differenzialmente espresse, una
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delle proteine che meglio discriminavano i noduli maligni dai benigni, oltre all‟ANXA1, precedentemente studiata nei nostri laboratori, è risultata essere l‟ANXA5. L‟ANXA5 è una proteina che è coinvolta nella coagulazione sanguinea ed è stata anche ampliamente studiata come indicatore di morte cellulare.
Lo scopo del presente lavoro di tesi è stato quindi quello di mettere a punto un kit ELISA per il riconoscimento della presenza della proteina in campioni biologici con raccolta meno invasiva rispetto all‟ago aspirato tiroideo: siero e saliva.
Validare il risultato ottenuto su ago aspirato tiroideo in siero e saliva sarebbe di grande utilità a livello diagnostico. Si tratta di un approccio rapido, minimamente invasivo e pre-operatorio, e potrebbe affiancare la valutazione citologica di FNA evitando, o almeno riducendo, gli errori di diagnosi sull‟ago-aspirato.
La prima parte del presente lavoro di tesi è pertanto consistita nella messa a punto di un dosaggio ELISA di tipo competitivo indiretto che rivelasse la presenza della proteina in campioni biologici.
Per la messa a punto abbiamo provato varie condizioni per il coating e per l‟incubazione dell‟anticorpo primario con la proteina standard in soluzione. Come si può vedere dalla tabella 2 siamo arrivati ad ottenere una retta standard con un‟ottima linearità (r2
=0.99) utilizzando un coating contenente 100 ng/ml di proteina ed una concentrazione di 25 ng/ml dell‟anticorpo primario (fig18).
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Tab2 risultati ottenuti con le diverse concentrazioni di standard per il coating e di anticorpo primario
coating (ng/ml) anticorpo primario (ng/ml) Sensibilità (ng/ml) retta 3000 3000 12.5-8000 saturazione 1000 1000 12.5-8000 saturazione 1000 100 12.5-8000 saturazione 1000 10 12.5-8000 saturazione 100 10 12.5-8000 r2 =0.97 100 25 6.25-4000 r2 =0.99 100 10 6.25-4000 r2 =0.97 100 10 25-1600 r2 =0.95 0 1000 2000 3000 4000 5000 0 20 40 60 80 concentrazione (ng/ml) A A ss o r b a n za ( % B /B 0 )
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Fig19: A) Grafico che illustra la relazione tra l‟assorbanza (espressa come percentuale
in rapporto al bianco) e la concentrazione dello standard ANXA5 utilizzato per la costruzione della retta di taratura. B) Linearizzazione del grafico A, ottenuta riportando il log dei valori sull‟asse x ed y. E‟ stata riportata l‟equazione della retta risultante, assieme al valore r2 che definisce l‟entità della linearità della retta stessa.
Una volta stabilite le condizioni di sensibilità del metodo (62.5-4000 ng/ml), siamo passati a testare i campioni di siero e saliva per individuare la diluizione che ci permettesse di rientrare nei limiti di sensibilità del kit, ed abbiamo alla fine settato una diluizione ottimale di 1:10 per entrambi i tipi di campioni.
Successivamente, abbiamo utilizzato questo kit per dosare l‟ANXA5 in alcuni campioni di siero e saliva. Nello specifico, abbiamo testato 44 campioni di siero e 44 di saliva. I campioni erano classificati, sulla base del risultato citologico dell‟ago aspirato tiroideo prelevato per la presenza di un nodulo, in benigni (n=11), maligni (n=11) e microfollicolari (n=22). I microfollicolari sono poi ulteriormente classificati, in seguito all‟analisi istologica dopo tiroidectomia, in maligni (n=11) e benigni (n=11).
0 1 2 3 4 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 y= 2.976-0.5949x r2= 0.99 B log (conc) lo g ( B /B 0 * 1 0 0 )
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Come possiamo vedere in fig20 la proteina mostra una tendenza all‟aumento sia nel siero che in campioni salivari di pazienti con noduli maligni.
Fig20: Analisi dei risultati ottenuti con saggio ELISA per l‟ANXA5 in siero e saliva.
Ogni colonna rappresenta il valore medio dell‟intensità del segnale ± SEM. La significatività del confronto tra noduli benigni e noduli maligni è stata valutata con il test statistico t-Student. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; n.s. non significativo.
BE NIG NI CA NC RO 0 5.0102 1.0103 1.5103 2.0103 SIERO n.s. in te n si tà s e g n a le (M S E M ) BENI GNI CA NC RO 0 2.0103 4.0103 6.0103 8.0103 SALIVA n.s. in te n si tà s e g n a le (M S E M )
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Questo dato si aggiunge ai molti dati presenti in letteratura che sostengono un possibile ruolo delle annessine nel processo oncogenico. In effetti le annessine sono tra le proteine più comunemente rivelate in studi proteomici e funzionali sui tumori [40]. Essendo delle “calcium- and phospholipid- binding proteins” sono associate con le metastasi nel carcinoma al fegato, polmone, colon, esofago, etc... In particolare l‟ANXA5 è una proteina di 36 KDa che sembra associata all‟apoptosi.
Successivamente abbiamo voluto focalizzare l‟attenzione sui noduli con citologia microfollicolare. Infatti biomarcatori per discriminare noduli maligni dai benigni sarebbero molto utili soprattutto in questi casi di noduli microfollicolari per evitare tiroidectomie non necessarie.
Come risulta evidente osservando la Fig21, i nostri risultati non hanno trovato differenza tra noduli microfollicari maligni e maligni col siero mentre mettono in evidenza un significativo aumento della proteina nei noduli microfollicolari poi rivelatisi maligni all‟istologia, rispetto a quelli poi risultati invece benigni, nella saliva.
MF _B MF _C 0 5.0102 1.0103 1.5103 2.0103 SIERO in te n si tà s e g n a le (M S E M )
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Fig21: Analisi dei risultati ottenuti con saggio ELISA per l‟ANXA5 in siero e saliva nei
campioni microfollicolari risultati benigni (MF_B) o tumori (MF_C) all‟istologia dopo tiroidectomia. Ogni colonna rappresenta il valore medio dell‟intensità del segnale ± SEM. La significatività del confronto tra noduli benigni e noduli maligni è stata valutata con il test statistico t-Student. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; n.s. non significativo
Pertanto, l‟aumento di espressione dell‟ANXA5 nei campioni di tumore maligno rispetto ai benigni, conferma la proteina come biomarker discriminante utile a distinguere tra carcinomi e tumori benigni. Inoltre i nostri risultati preliminari sulla saliva, suggeriscono anche la possibilità di utilizzare l‟ANXA5 come marker per la discriminazione delle lesioni microfollicolari maligne da quelle benigne. Questo dato è incoraggiante per nostri studi futuri, diretti proprio alla discriminazione di questi tipi di noduli poiché il loro trattamento chirurgico è fortemente controverso.
In conclusione, con questo lavoro di tesi è stato messo a punto un kit ELISA utile alla rilevazione della ANXA5 in campioni biologici quali siero e saliva. Inoltre, il nostro risultato preliminare su campioni ottenuti da soggetti con noduli tiroidei di diversa classificazione, conferma l‟importanza e la potenziale utilità del kit dell‟ANXA5 nella diagnosi dei tumori tiroidei, attraverso l‟utilizzo di campioni la cui raccolta è più
MF _B MF _C 0 5.0103 1.0104 1.5104 SALIVA
*
in te n si tà s e g n a le (M S E M ) n.s.66
semplice, meno invasiva e sicura rispetto al FNA. Dovremo però proseguire la validazione aumentando il numero dei campioni, in modo da aumentare la potenza statistica del risultato.
L‟introduzione di analisi specifiche, sicure e non invasive consentirebbero una drastica riduzione di interventi chirurgici non necessari con un impatto importante non solo sulla qualità della vita del paziente ma anche sul costo della sanità pubblica.
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BIBLIOGRAFIA
1. Welker, M. J.; Orlov, D. Thyroid nodules. Am. Fam. Physician
2003, 67 (3), 559-566.
2. Prasad, L. M.; Pellegata, S.N.; Huang, Y.; Nagaraja, N. N.; de la Chapelle, A.; Kloos, T. R. Galectin-3, fibronectin-1, CITED-1, HBME-1 and cytokeratin-19 immunohistochemistry is useful for the differential diagnosis of thyroid tumors. Mod. Pathol. 2005, 18 (1), 48-57.
3. Zeiger, M. A.; Dackiw, A. P. Follicular thyroid lesions, elements that affect both diagnosis and prognosis. J. Surg. Oncol. 2005, 89 (3), 108-113.
4. Saggiorato, E.; De Pompa, R.; Volante, M.; Cappia, S.; Arecco, F.; Dei Tos, A. P.; Orlandi, F.; Papotti, M. Characterization of thyroid “follicular neoplasms” in fine needle aspiration cytological specimens using a panel of immunohistochemical markers: a proposal for clinical application. Endocr. – Relat. Cancer 2005, 12 (2), 305-317.
5. Suriano, R.; Lin, Y.; Ashok, B.T.; Schaefer, S. D.; Schantz, S. P.; Geliebter, J.; Tiwari, R. K. Pilot study using SELDI-TOF-MS based protomi profile for the identification of diagnostic biomarkers of thyroid proliferative diseases. J. Proteome Res. 2006, 5 (4), 856-861. 6. Brown, L. M.; Helmke, S. M.; Hunsucker, S. W.; Netea-Maier, R.T.;
Chiang, S. A.; Heinz, D. E.; Shroyer, K. R.; Duncan, M. W.; Haugen, B. R. Quantitative and qualitative differences in protein expression between papillary thyroid carcinoma and normal tissue. Mol. Carcinog. 2006, 45 (8), 613-626.
68
7. Torres-Cabala, C.; Bibbo, M.; Panizo-Santos, A.; Barazi, H.; Krutzsch, H.; Roberts, D. D.; Merino, M. J. Proteomic identification of new biomarkers and application in thyroid cytology. ActaCytol.
2006, 50 (5), 518-528.
8. Krause, K.; Karger, S.; Schierhorn, A.; Poncin, S.; Many, M. C.; Fuhrer, D. Proteomic profiling of cold thyroid nodules. Endocrinology 2007, 148 (4), 1754-1763.
9. Ciregia, F.; Giusti, L.; Molinaro, A.; Niccolai, F.; Agretti, P.; Rago, T.; Di Coscio, G.; Vitti, P.; Basolo, F.; Iacconi, P.; Tonacchera, M.; Lucacchini, A. Presence in the Pre-surgical Fine-NeedleAspiration of Potential Thyroid Biomarkers Previously Identified in the Post- Surgical One. Plos One 2013, 8 (9),1-7.
10. Giusti, L.; Iacconi, P.; Ciregia, F.; Giannaccini, G.; Donatini, GL, et al. Fine-needle aspiration of thyroid nodules: protomi analysis to identify cancer biomarkers. J. Proteome Res. 2008, 7, 4079-4088 11. Martini. Timmons, Tallitsch “Anatomia Umana” edizione a cura di
Prof. Lucio Cocco, Prof. Eugenio Gaudio, Prof.ssa Lucia Manzuoli, Prof. Giovanni Zummo. Terza edizione Edises 2008
12. Robert M .Berne, Mattew N. Levy “ Principi di fisiologia” terza edizione a cura di Koeppen B.M, , Stanton B. A. Casa editrice Ambrosiana 2002
13. Dianzani MU. “Trattato di patologia generale”. 7ªed. UTET 1996, (2), 1569-1574
14. F.S Greenspan- G.J. Strewler “Endocrinologia Generale e clinica.”Presentazione del Prof. Franco Mantero Ordinario di Endocrinologia Dell‟Università di Padova. Edizione Piccin 2009
69
15. Robbins. Le basi patologiche delle malattie”. A cura di Cotran RS, Kumar V, Collins T. 6ªed.Piccin 26: 1309-1329 (2000)
16. Nagataki S, Nystrom E: “Epidemiology and primary prevention of thyroid cancer”. Thyroid 12:889-896 (2002)
17. Mazzaferri EL “Management of a solitary thyroid nodule” N Engl J Med 1993, 328, 553-559 e 337, 1675.
18. Hegedus L. “Clinical practice. The thyroid nodule”. N Engl J Med2004,
19. Sherman SI. “Thyroid carcinoma”. Lancet2003, 361, 501-511
20. Rosai J, et al. “Tumors of the thyroid gland”. In: Atlas of Tumor Pathology, Washington, DC, Armed Forces Institute of Pathology.
1990; p 49.
21. Schlumberger MJ. “Papillary and follicular Thyroid cancer”. N Engl J Med1998, 338, 297.
22. “Basi scientifiche per la definizione di linee-guida in ambito clinico per i tumori della tiroide dell‟epitelio follicolare”. www.progettooncologia.cnr.it. MIUR 2006.
23. Gagel RF, et al “Changing concepts in the pathogenesis and management of thyroid carcinoma”.Ca Cancer J Clin1996, 46, 221. 24. Tan RK. “Anaplastic carcinoma of the thyroid”. Head Neck 1995,
17,41
25. Pasquinelli F. “Diagnostica e tecniche di laboratorio. Aggiornamento su argomenti di chimica clinica e immunologia”. Rosini 1985, 8 (3), 285-286.
26. Federici G, e al. “Medicina di laboratorio”. 2ªed. Mc Graw Hill
70
27. Dionigi R. “Chirurgia. Basi teoriche e Chirurgia generale”. 3ªed.Masson 2002, 1 (1), 332-339.
28. Goodman&Gilman Le basi farmacologivhe della terapia dodicesima edizione a cura di Laurence Brunton, Bruce A. Chabrier e Bjorn C. Knollmann edizione Zanichelli 2012
29. Anderson NG, Anderson NL.Twenty years of two-dimensional electrophoresis: past, present and future. Electrophoresis 1996, 17, 443- 444.
30. Wasinger VC, Cordwell SJ, Cerpa-Poljak A, Yan JX, Gooley AA, Wilkins MR, Duncan MW, Harris R, Williams KL, and Humphery- Smith I.Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis 1995, 16, 1090-1094.
31. Wilkins MR, Sanchez JC, Gooley AA, Appel RD, Humphery- Smith I, Hochstrasser DF, and Williams KL. Progress with proteome projects: why all proteins expressed by a genome should be identified and how to do it. Biotechnol. Genet. Eng. Rev 1995, 13, 19-50.
32. Stults JT, Arnott D. Proteomics. Methods in enzymology 2005, (402), 245-278.
33. “Metodologie Biochimiche” a cura di Maria Carmela Bonaccorsi di Patti, Roberto Contestabille, Martino Luigi Di salvo, Casa Editrice Ambrosiana, Zanichelli Editore Bologna 2013
34. Metodologia biochimica: le bioscienze e le biotecnologie in laboratorio.”Edizione italiana a cura di Mirella e Loredano Pollegioni. A cura di Keith Wilson e John Walker. Raffaello Cortina Editore.
71
35. Santoro M, Melillo RM, Carlomagno F, Vecchio G, Fusco A. Minireview: “RET: normal and abnormal functions”. Endocrinology 2004; 145 (12): 5448-5451.
36. Saggiorato E, De Pompa R, Volante M, Cappia, S, Arecco F, Dei Tos AP, Orlandi F, Papotti M. “Characterization of thyroid “follicular neoplasms” in fine needle aspiration cytological specimens using a panel of immunohistochemical markers: a proposal for clinical application”. Endocrine-Related Cancer 2005; 12 (2): 305-317.
37. Srisomsap C, Subhasitanont P, Otto A, Mueller EC, Punyarit P, Wittmann-Liebold B, Svasti J. “Detection of cathepsin B up- regulation in neoplastic thyroid tissues by proteomic analysis”. Proteomics 2002; 2 (6): 706-712.
38. Brown LM, Helmke SM, Hunsucker SW, Netea-Maier RT, Chiang SA, Heinz DE, Shroyer KR, Duncan MW, Haugen BR. “Quantitative and qualitative differences in protein expression between papillary thyroid carcinoma and normal thyroid tissue”. Mol Carcinog 2006; 45 (8): 613-626.
39. Torres-Cabala C, Bibbo M, Panizo-Santos A, Barazi H, Krutzsch H, Roberts DD, Merino MJ. “Proteomic identification of new biomarkers and application in thyroid cytology”. Acta Cytol 2006; 50 (5): 518-528.)
40. Zong, J.; Guo, C.; Liu, S.; Sun, M. Z.; Tang, J. Proteomic research progress in lymphatic metastases of cancers. Clin. Transl. Oncol. 2012, 14, 21-30