I dati ottenuti con gli esperimenti eseguiti in questo lavoro dimostrano che parte dell’evento di morfogenesi cardiaca nello zebrafish è controllata dal microRNA 218, che questo miRNA è regolato dal fattore di trascrizione Tbx5 e che probabilmente esso svolge la sua azione regolando la corretta espressione di alcune proteine nei diversi distretti cardiaci.
Tbx5 è un fattore chiave dello sviluppo (Begemann and Ingham, 2000; Garrity, 2002; Ah net al., 2002) ed una sua perdita o silenziamento a stadi precoci causa aberrazioni nella morfogenesi cardiaca. Queste alterazioni si presentano con la formazione di un edema cardiaco tra le 48 e le 72 hpf ed il manifestarsi di una morfologia del cuore anomala, con trofia, looping e struttura aberranti (Garrity 2002 e Ahan 2002). Gli esperimenti condotti hanno validato questi dati e ne hanno aggiunti di nuovi, in quanto hanno dimostrato, per la prima volta in zebrafish, che anche una sovra- regolazione di Tbx5 provoca pesanti malformazioni sia cardiache sia della parte più anteriore della testa .
La spiegazione di questo fenomeno è intrinseca alla definizione di fattore di trascrizione: infatti poiché Tbx5 promuove l’espressione di una moltitudine di geni correlati alla morfogenesi cardiaca, è facile supporre che sia una sua riduzione che un suo significativo aumento possano provocare una deregolazione di componenti chiave del macchinario di sviluppo creando alterazioni nella corretta strutturazione del cuore. In accordo con i nostri dati, anomalie cardiache associate a duplicazione genica di tbx5 sono state riportate in letteratura per pazienti affetti dalla sindrome di Holt-Oram (MCCorquodale et al., 1986; Hatcher and Basson, 2001)
L’osservazione che, in zebrafish, la sovraregolazione di Tbx5 provochi difetti a livello della testa, e soprattutto a carico degli occhi, è più difficile da spiegare in quanto non sono riportati difetti in questi distretti in mutanti heartstring. Tuttavia, Tbx5 si esprime nell’occhio d’individui wild type: la sua espressione compare a livello di 6-7 somiti (12 hpf) nella metà temporale dei primordi dell’occhio e s’intensifica rapidamente allo stadio di 15-20 somiti (18-20 hpf) dove rimane confinata nella metà posteriore della retina (Begemann e Ingham, 2000). Analisi mediante PCR quantitativa realizzati nel nostro laboratorio hanno dimostrato che le microiniezioni del messaggero di tbx5 da noi effettuate causano un fortissimo aumento del messaggero di tbx5 durante le prime 15 ore; tra 15 e 20 ore il livello si abbassa e, a 48 ore, non è più distinguibile,
da quello di un embrione wild type. I nostri dati dimostrano quindi che, durante le prime ore di sviluppo, un forte aumento di Tbx5 con un pattern temporale e spaziale diverso da quello di controllo, in un distretto dove comunque Tbx5 si esprime e quindi i suoi target molecolari potrebbero essere presenti, può avere pesanti effetti sullo sviluppo dell’occhio. Viceversa, una riduzione di Tbx5 nella stessa area non sembra avere un grosso impatto suggerendo che, in questo distretto, Tbx5 possa attivare le sue funzioni più tardivamente.
Queste osservazioni sono in linea con un altro risultato ottenuto nel corso di questo lavoro di tesi: l’evidenza che slit 2 è regolato da Tbx5 (Fig. 4.10 dei risultati) in accordo anche con quanto riportato nel modello di Holt-Oram in topo (Mori et al., 2006). Dato che Slit 2 è molto espresso nelle regioni più anteriori della testa, come si nota anche nell’ibridazione in situ riportata in figura 4.10 dei risultati, è plausibile pensare che l’aumento di Tbx5 in quelle cellule con una tempistica scorretta, vada ad aumentare impropriamente l’ espressione di Slit 2. In un lavoro pubblicato nel 2001 è stato dimostrato come un aumento di Slit 2 in zebrafish generi embrioni con vari livelli di ciclopia evidente già a 16 ore dalla fecondazione (Yeo et al., 2001).
Se l’espressione del gene slit2 è modulata da Txb5, è corretto pensare che anche il miRNA218, contenuto in uno dei suoi introni e che viene quindi processato alla pari del gene stesso, sia anch’esso regolato da Tbx5. Numerose evidenze sperimentali supportano questa relazione tra miR-218 e slit2 come già discusso nell’introduzione.
La relazione tra il miRNA 218, i geni slit ed i geni robo nello sviluppo cardiaco del pesce zebra è stata descritta in letteratura come già riportato nell’introduzione di questa tesi (Fish et al., 2011). Tuttavia ciò che viene mostrato nel lavoro è come una sua forte riduzione di questo microRNA causi malformazioni nello sviluppo del cuore. I dati ottenuti nel corso del nostro lavoro dimostrano l’esatto contrario. In tutti gli esperimenti eseguiti infatti non è mai stata notata nessuna anomalia fenotipica in generale, né più in particolare a livello di vasi o di cuore, in seguito alla microiniezione né dello stesso morfolino utilizzato da Fish et al. per ridurre il miR-218, né di un morfolino sempre diretto contro lo stesso miRNA ma con sequenza leggermente diversa. Questi dati, ottenuti micro iniettando centinaia di embrioni anche con background genetici diversi, suggeriscono che, al contrario di quanto pubblicato, il miRNA 218 non sia presente o comunque non abbia un ruolo cruciale nelle primissime fasi di sviluppo dello zebrafish, il che rende totalmente vano un tentativo di knock-down, come dimostrato dagli
del miR-218 rallenti la migrazione, è comunque in contrasto con tutti i dati in letteratura che dimostrano come un aumento del miR-218 correli con un rallentamento della migrazione sia nei tessuti tumorali (Martinez et al., 2008; Tie et al., 2010) che nello sviluppo in topo (Small, 2010). Inoltre questo dato è in contraddizione anche con altre osservazioni degli stessi autori. Fish et al., infatti dimostrano anche che:
a) una riduzione di slit2, e quindi del miR-218 in esso contenuto, porta ad un aumento della migrazione;
b) una riduzione di Robo1, che è un target del miR-218 (Small et al., 2010; Chedotal, 2010) e che quindi dovrebbe diminuire quando il miR-218 aumenta, causa rallentamento della migrazione;
È invece catastrofica la sovra-regolazione, anche piccola, del miR-218 a stadi precoci, che causa negli embrioni, tra le 48 e le 72 ore, lo sviluppo di una morfologia cardiaca pesantemente disturbata, con serie malformazioni dell’atrio, del ventricolo, e della loro organizzazione nello spazio. Questo risultato non solo conferma l’ipotesi che il miRNA sia controllato da un fattore di trascrizione cardiaco, ma che anch’esso svolga un ruolo nell’organogenesi cardiaca.
Queste affermazioni sono supportate dagli esperimenti di recupero funzionale che mostrano come gli effetti catastrofici di una sovra-regolazione di Tbx5 vengano parzialmente recuperati da una concomitante diminuzione del miRNA 218 (Tab. 4.5 e Fig 4.12, 4.13 dei risultati).
Si può ipotizzare infatti che, se Tbx5 si avvale del miRNA 218 per controllare parte degli eventi morfogenetici cardiaci che da lui dipendono, i difetti cardiaci causati da una sovra-regolazione di Tbx5 (e quindi del miR-218) dovrebbero essere compensati da una coiniezione del morfolino contro il miR-218. Il morfolino infatti sequestra parte del miRNA maturo riportandone i livelli ad un valore circa ottimale, e quindi prevenendone gli effetti catastrofici dovuti al suo aumento.
Al contrario, il rescue tentato in modo inverso rispetto a quello presentato nel precedente paragrafo, ovvero diminuendo Tbx5 tramite iniezione del morfolino e micro iniettando il miRNA 218 maturo, non dà risultati di recupero del fenotipo bensì aggrava le malformazioni nei trattati. Questo risultato tuttavia è in accordo con le nostre precedenti osservazioni. Abbiamo infatti detto che l’assenza di effetti fenotipici a seguito dell’iniezione del MO-218 si spiega ipotizzando che probabilmente, a stadi molto precoci, il miR-218 non venga espresso o non abbia un ruolo importante. Questo significa che i danni cardiaci osservati a tempi precoci in seguito al knockdown di Tbx5
non sono neppure in parte dovuti ad una diminuzione del miR-218. Perciò non stupisce che, se si opera una coiniezione che causa un knockdown di Tbx5 ed un aumento del miR-218, si osservi un peggioramento del fenotipo in quanto si sommano i danni causati dalla alterazione di entrambi i regolatori, miRNA e fattore di trascrizione.
Infine con gli ultimi esperimenti riportati nella tesi si è voluto suggerire un probabile ruolo del miRNA 218 nei numerosi eventi e processi che portano alla corretta morfogenesi cardiaca. È mostrato infatti come, sebbene alcuni dei marcatori cardiaci fondamentali (notch, vmhc, amhc) si esprimano nella loro corretta posizione (Fig 4.17, 4.18, 4.19 dei risultati), altri potrebbero risultare delocalizzati, nel tempo o nello spazio. Un esempio che è stato riportato riguarda il gene tie2 che, espresso nel canale atrio ventricolare in una condizione wild type, assume una localizzazione diffusa negli embrioni iniettati con il miR-218 (Fig. 4.20 dei risultati).
Possiamo dunque concludere che gli esperimenti condotti nel corso di questo lavoro di tesi confermano che Tbx5 è un fattore di trascrizione con un ruolo chiave per il corretto sviluppo del cuore di zebrafish, che esso opera anche modulando i livelli di espressione di alcuni microRNA, e che il miRNA 218 è uno di questi. Inoltre gli esperimenti riportati suggeriscono che il miR-218 inizia a svolgere il suo ruolo tra le 48 e le 72 ore e che quindi una sua sovra-regolazione precoce può causare danni irreparabili allo sviluppo della morfogenesi cardiaca mentre una sua precoce sotto- regolazione non sembra provocare effetti dannosi significativi. Inoltre è probabile che le alterazioni del miRNA 218 vadano a deregolare l’espressione spazio temporale di un set genico più o meno vasto, di cui è stato identificato per adesso solo il gene tie2. Questo sarà un interessante argomento su cui proseguire le nostre indagini.
Referenze
1. Ackermann GE, Paw BH., 2003 “Zebrafish: a genetic model for vertebrate organogenesis and human disorders.” Front Biosci. 8,d1227-53.
2. Ahn DG, Kourakis MJ, Rohde LA, Silver LM, Ho RK., 2002 “T-box gene tbx5 is essential for formation of the pectoral limb bud.” Nature. 417,754-8.
3. Albalat R, Baquero M, Minguillón C., 2009 “Identification and characterisation of the developmental expression pattern of tbx5b, a novel tbx5 gene in zebrafish.” Gene Expr Patterns. 10,24-30.
4. Auman HJ, Coleman H, Riley HE, Olale F, Tsai HJ, Yelon D., 2007 “Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes.”
PLoS Biol 5,e53.
5. Bartel DP., 2004 “MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.” Cell. 116,:281-97.
6. Begemann G, Ingham PW., 2000 “Developmental regulation of Tbx5 in zebrafish embryogenesis.” Mech Dev. 90,299-304.
7. Brand T., 2003 “Heart development: molecular insights into cardiac specification and early morphogenesis.” Dev Biol. 258,1-19.
8. Brose K, Bland KS, Wang KH, Arnott D, Henzel W, Goodman CS, Tessier- Lavigne M, Kidd T., 1999 “Slit proteins bind Robo receptors and have an evolutionarily conserved role in repulsive axon guidance.” Cell. 96,795-806. 9. Bruneau BG, Logan M, Davis N, Levi T, Tabin CJ, Seidman JG, Seidman CE.,
1999 “Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt- Oram syndrome.” Dev Biol. 11,100-8.
10. Bruneau BG, Nemer G, Schmitt JP, Charron F, Robitaille L, Caron S, Conner DA, Gessler M, Nemer M, Seidman CE, Seidman JG., 2001 “A murine model of Holt-Oram syndrome defines roles of the T-box transcription factor Tbx5 in cardiogenesis and disease.” Cell. 106,709-721.
11. Bussmann J, Lawson N, Zon L, Schulte-Merker S; Zebrafish Nomenclature Committee., 2008 “Zebrafish VEGF receptors: a guideline to nomenclature.”
PLoS Genet. 4,e1000064.
12. Bussmann, J., Bakkers, J. and Schulte-Merker, S., 2007 “Early endocardial morphogenesis requires Scl/Tal1.” PLoS Genet. 3, e140.
13. Campbell et al., 2007 “Slit1a inhibits retinal ganglion cell arborization and synaptogenesis via Robo2-dependent and -independent pathways.” Neuron 55,231-245
14. Chédotal A., 2011 “Further tales of the midline.” Curr Opin Neurobiol. 21,68- 75.
15. Chen JF, Mandel EM, Thomson JM, Wu Q, Callis TE, Hammond SM, Conlon FL, Wang DZ., 2005 “The role of microRNA-1 and microRNA-133 in skeletal muscle proliferation and differentiation.” Nat Genet.38,228-33.
16. Crabtree GR, Olson EN., 2002 “NFAT signaling: choreographing the social lives of cells.” Cell. 109,67-79.
17. Dickson BJ, Zou Y., 2010 “Navigating intermediate targets: the nervous system midline.” Cold Spring Harb Perspect Biol.2.
18. Eisen JS, Smith JC., 2008 “Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense.” Development 135,1735-43.
19. Fish JE, Wythe JD, Xiao T, Bruneau BG, Stainier DY, Srivastava D, Woo S., 2011 “A Slit/miR-218/Robo regulatory loop is required during heart tube formation in zebrafish.” Development. 138,1409-19.
20. Garcia-Martinez V, Schoenwolf GC., 1993 “Primitive-streak origin of the cardiovascular system in avian embryos.” Dev Biol. 159,706-719.
21. Garrity DM, Childs S, Fishman MC., 2002 “The heartstrings mutation in zebrafish causes heart/fin Tbx5 deficiency syndrome.” Development. 129,4635- 4645.
22. Gjini E, Hekking LH, Küchler A, Saharinen P, Wienholds E, Post JA, Alitalo K, Schulte-Merker S., 2011 “Zebrafish Tie-2 shares a redundant role with Tie-1 in heart development and regulates vessel integrity.” Dis Model Mech. 4,57-66. 23. Habets PE, Moorman AF, Clout DE, van Roon MA, Lingbeek M, van Lohuizen
M, Campione M, Christoffels VM., 2002 “Cooperative action of Tbx2 and Nkx2.5 inhibits ANF expression in the atrioventricular canal: implications for cardiac chamber formation.” Genes Dev. 16,1234-46.
24. Hatcher CJ, Basson CT., 2011 “Getting the T-box dose right.” Nat Med. 11,1185-6.
25. Hatcher CJ, Kim MS, Mah CS, Goldstein MM, Wong B, Mikawa T, Basson CT., 2001 “TBX5 transcription factor regulates cell proliferation during cardiogenesis.” Dev Biol. 230,177-188.
26. Holt M, Oram S., 1960 “Familial heart disease with skeletal malformations.”
Heart 22,236-42.
27. Holtzman, N. G., Schoenebeck, J. J., Tsai, H. J. and Yelon, D., 2007 “Endocardium is necessary for cardiomyocyte movement during heart tube assembly.” Development 134, 2379-2386
28. Horb ME, Thomsen GH., 1999 “Tbx5 is essential for heart development.”
Development. 126,1739-1751.
29. Hutvágner G, McLachlan J, Pasquinelli AE, Bálint E, Tuschl T, Zamore PD., 2001 “A cellular function for the RNA-interference enzyme Dicer in the maturation of the let-7 small temporal RNA.” Science 293,834-8.
30. Ikeda S, He A, Kong SW, Lu J, Bejar R, Bodyak N, Lee KH, Ma Q, Kang PM, Golub TR, Pu WT., 2009 “MicroRNA-1 negatively regulates expression of the hypertrophy-associated calmodulin and Mef2a genes.” Mol Cell Biol. 29,2193- 204.
31. Ivey KN, Muth A, Arnold J, King FW, Yeh RF, Fish JE, Hsiao EC, Schwartz RJ, Conklin BR, Bernstein HS, Srivastava D., 2008 “MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells.” Cell Stem Cell. 2,219- 229.
32. Kimmel CB, Ballard WW, Kimmel SR, Ullmann B, Schilling TF., 1995 “Stages of embryonic development of the zebrafish.” Dev Dyn. 203,253-310.
33. Kimmel CB, Law RD., 1985 “Cell lineage of zebrafish blastomeres. II. Formation of the yolk syncytial layer.” Dev Biol. 108,86-93.
34. Langenbacher AD, Nguyen CT, Cavanaugh AM, Huang J, Lu F, Chen JN., 2011 “The PAF1 complex differentially regulates cardiomyocyte specification.” Dev
Biol. 353,19-28.
35. Lee Y, Ahn C, Han J, Choi H, Kim J, Yim J, Lee J, Provost P, Rådmark O, Kim S, Kim VN., 2003 “The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing.” Nature 425,415-9.
36. Leung CF, Webb SE, Miller AL., 2000 “On the mechanism of ooplasmic segregation in single-cell zebrafish embryos.” Dev Growth Differ. 42,29-40. 37. Liberatore CM, Searcy-Schrick RD, Yutzey KE., 2000 “Ventricular expression
of tbx5 inhibits normal heart chamber development” Dev Biol. 223,169-180. 38. Liu N, Olson EN., 2010 “MicroRNA regulatory networks in cardiovascular
development.” Dev Cell. 18, 510-525.
39. Liu N, Williams AH, Kim Y, McAnally J, Bezprozvannaya S, Sutherland LB, Richardson JA, Bassel-Duby R, Olson EN., 2008 “An intragenic MEF2- dependent enhancer directs muscle-specific expression of microRNAs 1 and 133.” Proc Natl Acad Sci U S A. 104,20844-9.
40. Martinez I, Gardiner AS, Board KF, Monzon FA, Edwards RP, Khan SA., 2008 “Human papillomavirus type 16 reduces the expression of microRNA-218 in cervical carcinoma cells.” Oncogene.27,2575-82.
41. McCorquodale MM, Rolf J, Ruppert ES, Kurczynski TW, Kolacki P., 1986 “Duplication (12q) syndrome in female cousins, resulting from maternal (11;12) (p15.5;q24.2) translocations.” Am J Med Genet. 24,613-22.
42. Mishima Y, Abreu-Goodger C, Staton AA, Stahlhut C, Shou C, Cheng C, Gerstein M, Enright AJ, Giraldez AJ., 2009 “Zebrafish miR-1 and miR-133 shape muscle gene expression and regulate sarcomeric actin organization.”
Genes Dev. 23,619-32.
43. Mori AD, Zhu Y, Vahora I, Nieman B, Koshiba-Takeuchi K, Davidson L, Pizard A, Seidman JG, Seidman CE, Chen XJ, Henkelman RM, Bruneau BG., 2006 “Tbx5-dependent rheostatic control of cardiac gene expression and morphogenesis.” Dev Biol. 297,566-86.
44. Morton SU, Scherz PJ, Cordes KR, Ivey KN, Stainier DY, Srivastava D., 2008 “microRNA-138 modulates cardiac patterning during embryonic development.”
Proc Natl Acad Sci U S A. 105,17830-5.
45. Qian, L., Liu, J. and Bodmer, R., 2005. “Slit and Robo control cardiac cell polarity and morphogenesis.” Curr. Biol. 15, 2271-2278.
46. Small EM, Sutherland LB, Rajagopalan KN, Wang S, Olson EN., 2010 “MicroRNA-218 regulates vascular patterning by modulation of Slit-Robo signaling.” Circ Res. 107,1336-44.
47. Tada M, Smith JC., 2001 “T-targets: clues to understanding the functions of T- box proteins.” Dev Growth Differ. 43,1-11.
48. Tessier-Lavigne M, Goodman CS., 1996 “The molecular biology of axon guidance.” Science. 274,1123-33.
49. Tie J, Pan Y, Zhao L, Wu K, Liu J, Sun S, Guo X, Wang B, Gang Y, Zhang Y, Li Q, Qiao T, Zhao Q, Nie Y, Fan D., 2010 “MiR-218 inhibits invasion and metastasis of gastric cancer by targeting the Robo1 receptor.” PLoS Genet. 6.
50. Verduci,L, Mercatanti,A, Cremisi, F and Pitto, L. 2010 “TBX5-dependent
miRNA expression in mouse heart” Atti in Frontiers of Cardiovascular Biology
Berlino.
51. Volinia S, Calin GA, Liu CG, Ambs S, Cimmino A, et al., 2006 “A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets.” Proc
Natl Acad Sci U S A 103,2257–2261.
52. Yamada M, Revelli JP, Eichele G, Barron M, Schwartz RJ., 2000 “Expression of chick Tbx-2, Tbx-3, and Tbx-5 genes during early heart development: evidence for BMP2 induction of Tbx2.” Dev Biol. 228, 95-105.
53. Yang B, Lin H, Xiao J, Lu Y, Luo X, Li B, Zhang Y, Xu C, Bai Y, Wang H, Chen G, Wang Z., 2007 “The muscle-specific microRNA miR-1 regulates
cardiac arrhythmogenic potential by targeting GJA1 and KCNJ2.” Nat Med. 13,486-91.
54. Yelon D, Horne SA, Stainier DY., 1999 “Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish.”
Dev Biol. 214,23-37.
55. Yeo SY, Little MH, Yamada T, Miyashita T, Halloran MC, Kuwada JY, Huh TL, Okamoto H., 2001 “Overexpression of a slit homologue impairs convergent extension of the mesoderm and causes cyclopia in embryonic zebrafish.” Dev
Biol 230,1-17.
56. Yi R, Qin Y, Macara IG, Cullen BR., 2003 “Exportin-5 mediates the nuclear export of pre-microRNAs and short hairpin RNAs.” Genes Dev. 17:3011-6. 57. Zhao Y, Samal E, Srivastava D., 2005 “Serum response factor regulates a
muscle-specific microRNA that targets Hand2 during cardiogenesis.” Nature. 436,214-20.
58. Zhao Y, Srivastava D., 2007 “A developmental view of microRNA function.”
Trends Biochem Sci. 32,189-197.
59. Zhong TP, Childs S, Leu JP, Fishman MC., 2001 “Gridlock signalling pathway fashions the first embryonic artery.” Nature. 414,216-20.
Ringraziamenti
Ringrazio babbo e mamma, che mi sostengono sempre in tutto, pur non capendo minimamente quello che faccio, il che a mio avviso è un’ottima dimostrazione di fiducia.
Ringrazio le sfere alte, Letizia, Federico, Sandro, Eva, che mi hanno sopportato durante la mia permanenza al CNR, e che si sono comportati con me come degli amici piuttosto che come dei superiori.
A Letizia inoltre vanno gli “special thanks” per non aver chiamato un esorcista dopo aver letto la prima stesura della tesi, ma per averla sia corretta sia tradotta dal toscano all’italiano con pazienza.
Ringrazio il lato buono di Elena, con cui ho condiviso gioie e dolori, sempre dietro a quei pesci che ogni giorno ce ne avevano una, ed a quelle teorie che tornavano per 9/10 e poi crollavano sempre sull’esperimento finale. Non ringrazio il lato cattivo invece, che mi ha causato troppo, ma veramente troppo stress, il lato cattivo mi deve dai 4 ai 7 anni di vita, credo.
Ringrazio Chià e Robbè, che hanno dentro lo spirito Nerd, come me, e con cui posso parlare di qualsiasi cosa (tante che la gente comune non comprende), sia intra- che extra- laboratorio.
Ringrazio Valentina per le sessioni di lezione al confocale.
Ringrazio tutti gli animali che hanno collaborato negli ultimi anni, sia a scopi lavorativi (tutti i pesci e Carrarmato, lo spazzacquario) che non (Pejo in primis, sia pre che post muta, Zardoz e i suoi fratelli schiusi nel terrario, i pesci e le chiocciole dell’acquario di scarto che hanno costruito un ecosistema da zero).
Ringrazio Kaliha, che anche se ho smesso di giocare per il poco tempo avuto in questo ultimo periodo si ricorda che sono ancora vivo.