Il tumore della mammella rappresenta una delle neoplasie più frequenti nelle donne nei Paesi occidentali. Negli ultimi 50 anni l’incidenza del tumore della mammella è aumentata, tanto che, è stato stimato che una donna su otto svilupperà una neoplasia mammaria nel corso della sua vita (J.Ferlay et al, 2010; F.Lalloo, 2012). I tumori ereditari della mammella rappresentano il 10% di tutte le neoplasie mammarie. I principali geni di suscettibilità ad alta penetranza sono rappresentati da BRCA1 e BRCA2. In presenza di mutazioni sul gene BRCA1 le donne hanno un rischio di sviluppare un tumore della mammella pari al 70-80% e un 50% di sviluppare un tumore dell’ovaio. Mentre, donne portatrici di mutazioni sul gene BRCA2 hanno un 50-60% di rischio di sviluppare un tumore della mammella e un 30% di sviluppare un tumore dell’ovaio (Roy R. et al, 2012).
La maggior parte delle mutazioni in BRCA1 portano all’espressione di una proteina tronca e non funzionale altre, invece, definite VUS (Variants of Unknown Significance) sono varianti di cui non è noto il significato patologico.
Negli ultimi anni sono stati sviluppati numerosi modelli predittivi e saggi funzionali con lo scopo di caratterizzare le VUS di BRCA1. Uno dei sistemi modello utilizzati per la caratterizzazione delle VUS di BRCA1 è Saccharomyces cerevisiae: in studi precedenti a questo lavoro, è stato messo a punto un saggio funzionale che permette di discriminare le VUS di BRCA1 patogenetiche da quelle non patogenetiche valutando il loro effetto sulla ricombinazione intra ed intercromosomica del ceppo diploide RS112.
S. cerevisiae è un ottimo sistema modello anche per la determinazione del ruolo dei pathways di riparazione del DNA nell’instabilità genomica indotta da BRCA1 poiché, anche se non possiede un omologo di questo gene, conserva gli stessi meccanismi di riparazione del DNA presenti nell’uomo. Sono stati quindi analizzati alcuni mutanti del ceppo aploide RSY6 di S. cerevisiae,ognuno deleto per uno specifico gene coinvolto nei pathways di riparazione del DNA (mlh1, msh2, msh6, mre11, rad50, rad51 e rad52). Tali ceppi sono stati trasformati con BRCA1 wt e alcune sue VUS e ne è stato valutato l’effetto sulla ricombinazione omologa e sulla frequenza di mutazione genica. Da questi esperimenti è emerso che l’espressione di BRCA1 wt o delle VUS nei ceppi deleti per msh2, msh6, mre11, rad50 e rad51, modifica la frequenza di ricombinazione omologa e mutazione genica.
Questi dati suggeriscono quindi che tali geni potrebbero avere un ruolo nell’instabilità genomica indotta da BRCA1.
Sulla base di questa ipotesi abbiamo voluto verificare se nei tumori di pazienti carrier di VUS di BRCA1 questi geni risultassero alterati nella loro funzione per causa di una mutazione patogenetica.
In questo lavoro è stata quindi condotta un’analisi mutazionale dei geni MSH6, MRE11A, RAD50 e RAD51sul DNA estratto da tessuto tumorale mammario di pazienti carrier di UV del gene BRCA1, tramite sequenziamento delle regioni codificanti e delle giunzioni introne-esone utilizzando la tecnologia PGM ION TORRENT.
L’analisi è stata condotta su un campione di 13 pazienti affette da carcinoma mammario. Dall’analisi mutazionale sono state individuate
32 varianti: 10 esoniche e 22 introniche. Tra le 32 varianti ne sono state selezionate 7 come più interessanti: 5 esoniche e 2 introniche. Delle 5 varianti esoniche, 3 sono state individuate in MSH6 e 2 in RAD50 mentre le due varianti introniche sono state individuate in MRE11A e in RAD50.
Tali varianti selezionate sono state confermate per valutare che non fossero dei falsi e per escludere l’origine germinale della mutazione.
La variante missenso p.Asn345Tyr di MSH6 individuata in eterozigosi nella paziente Pisa258PK non è descritta nei database, è predetta come possibly damaging dall’algoritmo polyphen con uno score dello 0.594 ed è di origine somatica.
La variante sinonima p.Ala729Ala di MSH6 individuata in eterozigosi nella paziente Pisa534, non è descritta nei database ed è di origine germinale.
La variante missenso p.Arg841Lys di MSH6 individuata in eterozigosi nella paziente Pisa881, non è descritta nei database, è predetta come patogenetica ed è di origine somatica.
La variante missenso p.Asn310Lys di RAD50 individuata nella paziente Pisa63, non è riportata nei database, è predetta come probabilmente deleteria dal software polyphen e si presume che sia di origine somatica data la bassa frequenza con la quale è stata individuata e verrà in futuro confermata per escludere che sia un falso. La variante sinonima p.Asp675Asp di RAD50 individuata in eterozigosi nella paziente Pisa614, riportata nel database dbSNP è di origine germinale.
Le due varianti introniche selezionate come significative in quanto localizzate in prossimità della giunzione introne-esone: IVS5-5C>T di MRE11A e IVS20-4 A>T di RAD50 sono entrambe di origine germinale.
Per il gene MSH6 è stata condotta su FFPE DNA l’analisi dei riarrangiamenti attraverso la tecnica MLPA che ha evidenziato in due pazienti: Pisa563 e Pisa952, l’intera delezione dei 10 esoni del gene. Questo risultato, associato con quello dell’analisi di sequenziamento, suggerisce un ruolo importante per il gene hMSH6 nella carcinogenesi mammaria ,perlomeno nelle forme familiari correlate al gene BRCA1. Infatti, nel 15 % dei tumori mammari analizzati (2/13) sono state identificate mutazioni somatiche probabilmente patogenetiche e mai descritte in precedenza e in un altro15% (2/13), delezioni somatiche dell’intero gene. Per quanto a nostra conoscenza, questo è il primo studio che indica un ruolo del gene MSH6 nella carcinogenesi mammaria BRCA1-relata.
Non altrettanto chiaro è il ruolo del gene RAD50, infatti l’unica variante missenso identificata potrebbe essere un falso sperimentale perché si trova solo nel 3% delle reads e non è stato ad oggi possibile avere la conferma della sua presenza mediante la tecnica della Digital PCR.
Per quanto riguarda il gene MRE11A, da questo screening mutazionale non sono emersi risultati significativi, tuttavia, il suo eventuale coinvolgimento con la patologia non può essere del tutto escluso a causa dello scarso numero di campioni sottoposti all’analisi.
Anche in RAD51 non sono state individuate varianti interessanti. Dalla letteratura è noto che questo gene si trova overespresso nei tumori della mammella. L’overespressione di RAD51 ha come effetto eventi di ricombinazione aberranti nelle cellule (amplificazioni cromosomiche, delezioni e traslocazioni). Tale overespressione sembrerebbe essere dovuta ad un’aumentata trascrizione e ad una riduzione dei processi di metlilazione ma non ad eventi di amplificazione genica (Raderschall et al.,2002; Min A et al.,2013). Le cellule che overesprimono RAD51 mostrano resistenza all’apoptosi e presentano alterazioni a livello del ciclo cellulare (Sarasin A et al.,2008; Schild D and Wiese C.,2010; Brown ET and HoltJT.,2009). Sulla base di queste informazioni, all’analisi mutazionale del gene condotto in questo lavoro di tesi potrebbe quindi essere utile associare uno studio di espressione della proteina RAD51 nei tumori analizzati. Inoltre, due geni omologhi di RAD51(RAD51C e RAD51D) sembrerebbero avere un ruolo nella predisposizione al tumore della mammella e dell’ovaio (Chey Loveday et al.,2011) e quindi in futuro l’analisi mutazionale potrà essere estesa a tutta questa famiglia genica.
Questo studio si può considerare un’analisi preliminare dato l’esiguo numero di campioni analizzati, sarebbe quindi opportuno in futuro ampliare la casistica estendendo l’analisi a soggetti portatori di mutazioni deleterie di BRCA1 e a soggetti wild type per BRCA1 .
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