2. Materiali e Metodi
2.6 Caratterizzazione biochimica di AniA
2.6.1 Dosaggi di attività enzimatica a divers
Le cinetiche enzimatiche sono state condotte a diversi valori di pH, compresi in un range che va da 4.5 a 7, mediante l’utilizzo di opportuni tamponi. La miscela di reazione è costituita dalle seguenti concentrazioni:
- 33.6mM di tampone al pH cui viene condotto l’esperimento - 2mM di nitrito
- 0.7mM di metil viologeno - 14mM ditionito
- 11nM AniA
Le provette contenenti le miscele di reazione sono state incubate in bagnetto a 37°C a diversi tempi prefissati: 1, 2, 5, 10 min; scaduti i quali vengono vortexate finchè la soluzione non diventa chiara, per eliminare il potere riducente extra e bloccare così la reazione enzimatica. A questo punto aggiungiamo in sequenza nelle cuvette da 3ml:
- 50μl dei mix di reazione ai diversi tempi di incubazione - 150μl di H2O
- 1ml di acido sulfanilico 1% in acido fosforico 5% e si lascia per 5 min in incubazione a temperatura ambiente e al buio
- 1ml di NED 0.1% in acqua e si lascia in incubazione al buio a temperatura ambiente per 20min per lo sviluppo del calore
La quantificazione dei nitriti in soluzione viene determinata misurando l’assorbanza a 540nm, mediante estrapolazione della concentrazione della retta di taratura .
Ai valori di velocità enzimatica calcolati ai vari pH vanno sottratti i valori di velocità di autoriduzione del nitrito dipendenti dal pH. Per il calcolo delle velocità cinetiche ad ogni tempo di incubazione, ai vari valori di pH, abbiamo proceduto nel seguente modo. Abbiamo mediato i vari dati di concentrazione dei nitriti espressi in μmol/l ai diversi tempi prefissati e li abbiamo moltiplicati per il fattore di diluizione in cuvetta, in modo da ottenere la concentrazione effettiva nella miscela. I valori di concentrazione espressi in mM ai diversi tempi, sono stati fittati tramite una regressione lineare utilizzando il programma Grafit, ed il relativo coefficiente angolare ci fornisce il valore di velocità di scomparsa del nitrito espresso in mM/min. Poiché il valore di velocità calcolato è relativo ad un litro di soluzione, lo apportiamo ai 500μl della miscela di reazione, esprimendolo in μmol/min. A tale valore di riduzione enzimatica sottraiamo il relativo valore di autoriduzione per ottenere la velocità enzimatica reale. A questo punto calcoliamo l’attività specifica definita come:
A.S.= U/mgproteina
Dove A.S.: attività specifica; U:unità enzimatica; mgproteina: mg di enzima nella miscela di reazione
Le unità enzimatiche rappresentanti le μmol di nitrito ridotte al minuto sono date dai valori di velocità enzimatica reale, mentre la quantità di enzima presente nel mix espresso in mg è 0.0002mg.
2.6.2 Cinetica enzimatica di AniA
Le costanti enzimatiche apparenti di AniA, come Km e Kcat sono state definite a diversi valori di pH, mediante un metodo spettrofotometrico che valuta l’ossidazione dal ditionito a 315nm (Zelda L. Abraham, 1997).
Le cinetiche enzimatiche sono state condotte variando le concentrazioni di nitrito (50μM, 100 μM, 200 μM, 400 μM) ad ogni punto di pH, mentre la concentrazione di ditionito è stata mantenuta in largo eccesso rispetto alla concentrazione di nitrito, in modo da mantenere il sistema in condizioni di pseudo-primo ordine. Nella cuvetta tonometrica vengono messi 5ml di miscela di reazione formata da: tampone 100mM al pH prefissato, nitrito di sodio alla concentrazione prestabilita, ditionito di sodio 10.3mM. Una volta create le condizioni di microaerobiosi tramite una pompa da vuoto, il ditionito viene disciolto nella miscela. A questo punto si preleva 1ml di mix di reazione e si mette in una cuvetta da 0.2cm di cammino ottico preventivamente degassata. Si azzera contro il campione, valutando l’ossidazione del ditionito a 315nm per 10min dopo aver iniettato nella cuvetta AniA 110nM.
Di ogni singolo punto di ossidazione enzimatica del ditionito abbiamo calcolato la velocità espressa in ΔA/min dal coefficiente angolare della retta della porzione pendente della curva. A questi valori sono stati sottratti punto per punto le velocità di autoossidazione del ditionito per ottenere le velocità enzimatiche reali. Data la legge di Lambert-Beer:
A= ελ • l • C
dove A: assorbanza, ελ: coefficiente di estinzione molare, l: cammino ottico della radiazione nella soluzione, C: concentrazione della soluzione che assorbe la luce.
Trasformiamo i valori di velocità da ΔA/min a ΔC/min sapendo che ελ = 8mM-1 cm-1 ed l= 0.2 cm. Essendo la reazione enzimatica catalizzata da AniA, per ogni micromole di ditionito ossidato si forma una micromole di ossido nitrico; quindi il valore positivo
delle velocità di ossidazione del ditionito indirettamente rappresenta la velocità di formazione dell’NO. Fittando i dati di velocità alle varie concentrazioni di nitrito con l’equazione di Michaekis Menten tramite il programma Grafit, si ottengono le costanti cinetiche apparenti: Vmax e Km. La costante catalitica Kcat è data dalla seguente formula: Kcat = Vmax / [Etot]
dove Kcat = costante catalitica, Vmax = velocità massima, [Etot]= concentrazione totale di enzima in cuvetta. Si calcolano le costanti catalitiche ai vari pH conoscendo i relativi valori di Vmax e sapendo che [Etot]= 0.1μM.
2.7 Crescita in brodo e consumo del nitrito di ceppi di isolamento clinico
Per valutare la crescita di N. meningitidis in MHB in presenza e in assenza di 2mM NaNO2, in condizioni di microaerofilia, sono stati selezionati i ceppi di meningococco rappresentanti le varianti del gene aniA. I ceppi di N. meningitidis congelati sono stati seminati su piastre di TM. Il giorno successivo, ciascun brodo è stato inoculato in MHB ad una OD600nm=0.08 e fatto crescere per circa 18-19 ore, in agitazione. La mattina seguente, per ogni ceppo sono state eseguite due subcolture in MHB ad una OD600nm=0.08, sempre in agitazione, una coltura senza e una coltura con 2mM di NaNO2. A questo punto ogni brodo è stato incubato in microaerofilia e la curva di crescita è stata monitorata dal tempo zero (T0) al tempo di 24 ore (T24), valutando la crescita di ogni batterio dalla misura dell’OD600nm. Parallelamente alla crescita, è stato misurato il consumo di nitrito nel tempo, tramite la reazione colorimetrica di Griess, in tutti i ceppi di N. meningitidis cresciuti in presenza di nitrito. La prima misura del nitrito è stata eseguita a T0, e le successive, ogni 2ore e 30min fino ad arrivare fase stazionaria. In particolare, da ogni coltura in brodo è stata prelevata un’aliquota e centrifugata, il sovranatante ottenuto è stato aggiunto alla miscela di reazione costituita dai reagenti di
Griess, seguendo gli stessi tempi e condizioni di incubazione già descritti nel paragrafo 2.6. La lettura dell’assorbanza è stata eseguita a 540nm e l’OD, così ottenuta, è riportata sul grafico della retta standard di riferimento per i nitriti, dove per una data OD si ricava la concentrazione di nitrito corrispondente, e quindi la quantità di nitrito consumata per ogni ceppo esaminato.
3. RISULTATI
3.1 Analisi della sequenza nucleotidica e aminoacidica del gene aniA
L’intero gene aniA è stato amplificato in tutti i ceppi di N. meningitidis esaminati (tabella 1). 2 ceppi, non invasivi, per la presenza del gene codificante la trasposasi NMB1251 non hanno dato nessuna amplificazione. In particolare, l’analisi è stata eseguita su 19 ceppi di isolamento clinico invasivi di N. meningitidis e su 2 ceppi non invasivi, isolati in Italia. La sequenza è stata analizzata paragonandola verso il ceppo di riferimento N. meningitidis MC58 di sierogruppo B e verso il ceppo commensaleN. lactamica.
La figura 12 mostra l’allineamento della sequenza aminoacidica di AniA. I residui corrispondenti al sito catalitico (D137 e H280 ) sono evidenziati in verde e la sequenza del peptide segnale (MKRQALAAMIASLFALAAC) è sottolineata. La maggior parte delle mutazioni trovate sono nella regione ammino-terminale della proteina: tra il residuo 1 e il residuo 100 (facendo riferimento alla sequenza del gene aniA di MC58: AE002098/AAF41975).
In due ceppi invasivi, 1661 e 1759, sono state trovate molte mutazioni “frame-shift” creando codoni di stop e quindi una struttura tronca della proteina. Il sito di palmitoilazione, cisteina in posizione 19, è mutato in un residuo di glicina in due ceppi, nel ceppo non invasivo 100 e nel ceppo invasivo 1857. Nei ceppi 1012 e 1159 sono state trovate quattro e due mutazioni, rispettivamente, all’interno della sequenza segnale che potrebbero interferire con il trasporto della proteina nel periplasma così da indurre, probabilmente, un fallimento della localizzazione. La sequenza dei ceppi 1332, 1284, 1661, 1759, 1892, 1447, 1682 e 1798 ha mostrato una delezione di quattro aminoacidi nella stessa posizione: dal residuo 28 al residuo 31. Tre ceppi: 1012, 1765 e 1891,
hanno mostrato gli stessi tre aminoacidi inseriti in posizione 35, 36 e 41, e un aminoacido deleto in posizione 27. Questi stessi ceppi hanno altre mutazioni in posizione 60, 61, 70, 71 e 75.
Una inserzione di 9 aminoacidi in posizione 143 vicino al sito di legame del rame di tipo I è stata trovata nel ceppo 1332, che insieme al ceppo 1892, hanno il sito catalitico mutato: H280→L, e solo il ceppo 1892 ha V281→R.
Infine, i ceppi 1159, 1239, 1332, 1284, 1447 e 1682 hanno mostrato due identiche mutazioni in posizione 35 e 51.
Nonostante la presenza di numerose mutazioni puntiformi nella sequenza nucleotidica, i dendrogrammi ottenuti dall’allineamento sia della sequenza nucleotidica sia della sequenza aminoacidica hanno rivelato un alto grado di somiglianza tra 85% e 95%, come mostrato in figura 13A, e B.
TABELLA 1. Ceppi di N. meningitidis esaminati per il gene aniA
CODICE CEPPO SIEROGRUPPO
CAPSULARE ANNO DI ISOLAMENTO QUADRO CLINICO 1012 B 1999 SEPSI 1043 B 2000 MENINGITE 100 C 2000 NON INVASIVO 1159 B 2001 MENINGITE 297 B 2001 NON INVASIVO 1200 B 2002 SEPSI 1239 C 2002 SEPSI 1284 C 2002 MENINGITE 1332 C 2003 MENINGITE+SEPSI 1447 W135 2004 MENINGITE+SEPSI 1661 C 2005 MENINGITE 1682 Y 2005 MENINGITE 1759 C 2005 - 1765 B 2005 SEPSI 1774 W135 2005 - 1798 C 2006 SEPSI 1849 B 2006 - 1851 B 2006 MENINGITE 1857 B 2006 MENINGITE 1891 B 2006 SEPSI 1892 Y 2006 MENINGITE
-
: non notoMC58 MKRQALAAMI ASLFALAAC GGEPAAQAPA ETPAA--AAEA –ASSAAQTAAE
N.l. MKRQALAAMI ASLFALAAC GGEPAAQAPA ETPAA--SAEA -ASSAAQTAAE
100 MKRQALAAMI ASLFALAAG GGEPAAQAPA ETPAA--AAEA -ASSAAQTAAE 1043 MKRQALAAMI ASLFALAAC GGEPAAQAPA ETPAA--AAEA -ASSAAQTAAE 1200 MKRQALAAMI ASLFALAAC GGEPAAQAPA ETPAA--AAEA -ASSAAQTAAE 1159 MKRQALSEII ASMFALAAC GGEQAAQAPA ETPAA--SAEA -SSSAAQTAAE 1332 MKRQALAAMI ASLFALAAC GGEPAAQA-- --PAA--SAEA -ASSAAQTAAE 1239 MKRQALAAMI ASLFALAAC GGEQAAQAPA ETPAA--SAEA -ASSAAQAAAE 1284 MKRQALAAMI ASLFALAAC GGEPAAQA-- --PAA--SAEA -ASSAAQTAAE 297 MKRQTLAALI ASVFALAAC –GEQAAK-PA ETPAATASAEA PAASNSQAAAE 1012 MKRQTLAALI ASVFALAAC -GEQAAKP-A ETPAATASAEA PAASNSQAAAE 1857 MKRQALAAMI ASLFALAAG GGEPAAQAPA ETPAA--AAEA -ASSAAQTAAE 1849 MKRQALAAMI ASLFALAAC GGEPAAQAPA ETPAA--AAEA -ASSAAQTAAE 1851 MKRQALAAMI ASLFALAAC GGEPAAQAPA ETPAA--AAEA -ASSAAQTAAE 1661 MKRQALAAMI ASLFALAAC GGEPAAQA-- --PAA--SAEA -ASSAAQTAAE 1759 MKRQALAAMI ASLFALAAC GGEPAAQA-- --PAA--SAEA -ASSAAQTAAE 1774 MKRQALAAMI ASLFALAAC GGEQAAQAPA ETPAA--SAEA -ASSAAQTAAE 1798 MKRQALAAMI ASLFALAAC GGEPAAQA-- --PAA--AAEA -ASSAAQTAAE 1892 MKRQALAAMI ASLFALAAC GGEPAAQA-- --PAA--SAEA -ASSAAQTAAE 1447 MKRQALAAMI ASLFALAAC GGEPAAQA-- --PAA--SAEA -ASSAAQAAAE 1682 MKRQALAAII ASMFALAAC GGEPAAQT-- --PAA--SAEA -ASSAAQTAAE 1765 MKRQTLAALI ASVFALAAC –GEQAAK-PA ETPAATASAEA PAASNSQAAAE 1891 MKRQTLAALI ASVFALAAC -GEQAAK-PA ETPAATASAEA PAASNSQAAAE
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N.l. TPSGELPVID AVTTHAPEVP PAIDRDYPAK VRVKMETVEK TMKMDDGVEY
100 TPSGELPVID AVTTHAPEVP PAIDRDYPAK VRVKMETVEK TMTMEDGVEY 1043 TPSGELPVID AVTTHAPEVP PAIDRDYPAK VRVKMETVEK TMTMEDGVEY 1200 TPSGELPVID AVTTHAPEVP PAIDRDYPAK VRVKMETVEK TMTMEDGVEY 1159 TPAGELPVID AVTTHAPEVP PAIDRDYPAK VRVKMETVEK TMKMDDGVEY 1332 TPAGELPVID AVTTHAPEVP PAIDRDYPAK VRVKMETVEK TMTMEDGVEY 1239 TPAGELPVID AVTTHAPEVP PAIDRDYPAK VRVKMETVEK TMTMEDGVEY 1284 TPAGELPVID AVTTHAPEVP PAIDRDYPAK VRVKMETVEK TMTMEDGVEY 297 TPSSELPVID AIVTHAPEVP PPTDRDHPAK VRVKMETVEK TMKMDDGVEY 1012 TPSSELPVID AIVTHAPEVP PPTDRDHPAK VRVKMETVEK TMKMDDGVEY 1857 TPSGELPVID AVTTHAPEVP PAIDRDYPAK VRVKMETVEK TMTMEDGVEY 1849 TPSGELPVID AVTTHAPEVP PAIDRDYPAK VRVKMETVEK TMTMEDGVEY 1851 TPSGELPVID AVTTHAPEVP PAIDRDYPAK VRVKMETVEK TMTMEDGVEY 1661 TPTGELPVID AVTTHAPEVP PAIDRDYPAK VRVKMETVEK P∗---WKT 1759 TPTGELPVID AVTTHAPEVP PAIDRDYPAK VRVKMETVEK P∗---WKT 1774 TPSGELPVID AVTTHAPEVP PAIDRDYPAK VRVKMETVEK TMKMDDGVEY 1798 TPSGELPVID AVTTHAPEVP PAIDRDYPAK VRVKMETVEK TMTMEDGVEY 1892 TPTGELPVID AVTTHAPEVP PAIDRDYPAK VRVKMETVEK TMTMEDGVEY 1447 TPAGELPVID AVTTHAPEVP PAIDRDYPAK VRVKMETVEK TMKMDDGVEY 1682 TPAGELPVID AVTTHAPEVP PAIDRDYPAK VRVKMETVEK TMKMDDGVEY 1765 TPSSELPVID AIVTHAPEVP PPTDRDHPAK VRVKMETVEK TMKMDDGVEY 1891 TPSSELPVID AIVTHAPEVP PPTDRDHPAK VRVKMETVEK TMKMDDGVEY
10 19 29 38 48
58 68 78 88 98
MC58 RYWTFDGDVP GRMIRVREGD TVEVEFSNNP SSTVPHNVDF HAATG---
N.l. RYWTFDGDVP GRMIRVREGD TVEVEFSNNP SSTVPHNVDF HAATG--- 100 RYWTFDGDVP GRMIRVREGD TVEVEFSNNP SSTVPHNVDF HAATG--- 1043 RYWTFDGDVP GRMIRVREGD TVEVEFSNNP SSTVPHNVDF HAATG--- 1200 RYWTFDGDVP GRMIRVREGD TVEVEFSNNP SSTVPHNVDF HAVTG--- 1159 RYWTFDGDVP GRMIRVREGD TVEVEFSNNP SSTVPHNVDF HAATG--- 1332 RYWTFDGDVP GRMIRVREGD TVEVEFSNNP SSTVPHNVDF HAATGQGGGA 1239 RYWTFDGDVP GRMIRVREGD TVEVEFSNNP SSTVPHNVDF HAATG--- 1284 RYWTFDGDVP GRMIRVREGD TVEVEFSNNP SFTVPHNVDF HAATG--- 297 HYWTFDGDVP GRMIRVREGD TVEVEFSNNP SSTVPHNVDF HAATG--- 1012 HYWTFDGDVP GRMIRVREGD TVEVEFSNNP SSTVPHNVDF HAATG--- 1857 RYWTFDGDVP GRMIRVREGD TVEVEFSNNP SSTVPHNVDF HAATG--- 1849 RYWTFDGDVP GRMIRVREGD TVEVEFSNNP SSTVPHNVDF HAATG--- 1851 RYWTFDGDVP GRMIRVREGD TVEVEFSNNP SSTVPHNVDF HAATG--- 1661 VWNTATGHLT ATFRVA∗SAY AKAIRLKWNF PTTRLLPFPI TSTSTP---- 1759 VWNTATGHLT ATFRVA∗SAY AKAIRLKWNF PTTRLLPFPI TSTSTP---- 1774 HYWTFDGDVP GRMIRVREGD TVEVEFSNNP SSTVPHNVDF HAATG--- 1798 RYWTFDGDVP GRMIRVREGD TVEVEFSNNP SSTVPHNVDF HAATG--- 1892 RYWTFDGDVP GRMIRVREGD TVEVEFSNNP SSTVPHNVDF HAATG--- 1447 RYWTFDGDVP GRMIRVREGD TVEVEFSNNP SSTVPHNVDF HAATG--- 1682 RYWTFDGDVP GRMIRVREGD TVEVEFSNNP SSTVPHNVDF HAATG--- 1765 HYWTFDGDVP GRMIRVREGD TVEVEFSNNP SSTVPHNVDF HAATG--- 1891 HYWTFDGDVP GRMIRVREGD TVEVEFSNNP SSTVPHNVDF HAATG---
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N.l. ----QGGGAA ATFTAPGRTS TFSFKALQPG PDIYHCAVAP --VGMHIANG 100 ----QGGGAA ATFTAPGRTS TFSFKALQPG LYIYHCAVAP --VGMHIANG 1043 ----QGGGAA ATFTAPGRTS TFSFKALQPG LYIYHCAVAP --VGMHIANG 1200 ----QGGGAA ATFTAPGRTS TFSFKALQPG LYIYHCAVAP --VGMHIANG 1159 ----QGGGAA ATFTAPGRTS TFSFKALQPG LYIYHCAVAP --VGMHIANG 1332 AATGQGGGAA ATFTAPGRTS TFSFKALQAG LYIYHCAVAP --VGMHIANG 1239 ----QGGGAA ATFTAPGRTS TFSFKALQPG LYIYHCAVAP --VGMHIANG 1284 ----QGGGAA ATFTAPGRTS TFSFKALQAG LYIYHCAVAP --VGMHIANG 297 ----QGGGAA ATFTAPGRTS TFSFKALQAG LYIYHCAVAP --VGMHIANG 1012 ----QGGGAA ATFTAPGRTS TFSFKALQAG LYIYHCAVAP --VGMHIANG 1857 ----QGGGAA ATFTAPGRTS TFSFKALQPG LYIYHCAVAP --VGMHIANG 1849 ----QGGGAA ATFTAPGRTS TFSFKALQPG LYIYHCAVAP --VGMHIANG 1851 ----QGGGAA ATFTAPGRTS TFSFKALQPG LYIYHCAVAP --VGMHIANG 1661 ----QPVRAA VQPQPLPPRA ALPHSASKPC NRVCTSTTAP SRRSVCTSPT 1759 ----QPVRAA VQPQPLPPRA ALPHSASKPC NRVCTSTTAP SRRSVCTSPT 1774 ----QGGGAA ATFTAPGRTS TFSFKALQPG LYIYHCAVAP --VGMHIANG 1798 ----QGGGAA ATFTAPGRTS TFSFKALQAG LYIYHCAVAP --VGMHIANG 1892 ----QGGGAA ATFTAPGRTS TFSFKALQPG LYIYHCAVAP --VGMHIANG 1447 ----QGGGAA ATFTAPGRTS TFSFKALQPG LYIYHCAVAP --VGMHIANG 1682 ----QGGGAA ATFTAPGRTS TFSFKALQPG LYIYHCAVAP --VGMHIANG 1765 ----QGGGAA ATFTAPGRTS TFSFKALQAG LYIYHCAVAP --VGMHIANG 1891 ----QGGGAA ATFTAPGRTS TFSFKALQAG LYIYHCAVAP --VGMHIANG
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N.l. PEYVVFNGHV GSIAGDNALK AKAGETVRMY VGNGGPNLVS SFHVIG---E 100 PEYVVFNGHV GAIAGDNALK AKAGETVRMY VGNGGPNLVS SFHVIG---E 1043 PEYVVFNGHV GAIAGDNALK AKAGETVRMY VGNGGPNLVS SFHVIG---E 1200 PEYVVFNGHV GAIAGDNALK AKAGETVRMY VGNGGPNLVS SFHVIG---E 1159 PEYVVFNGHV GAIAGDNALK AKAGETVRMY VGNGGPNLVS SFHVIG---E 1332 PEYVVFNGHV GAIAGDNALK AKAGETVRMY VGNGGPNLVS SFLVIG---E 1239 PEYVVFNGHV GAIAGDNALK AKAGETVRMY VGNGGPNLVS SFHVIG---E 1284 PEYVVFNGHV GAIAGDNALK AKAGETVRMY VGNGGPNLVS SFHVIG---E 297 PEYVVFNGHV GSIAGDNALK AKAGETIRMY VGNGGPNLVS SFHVIG---E 1012 PEYVVFNGHV GSIAGDNALK AKAGETIRMY VGNGGPNLVS SFHVIG---E 1857 PEYVVFNGHV GAIAGDNALK AKAGETVRMY VGNGGPNLVS SFHVIG---E 1849 PEYVVFNGHV GAIAGDNALK AKAGETVRMY VGNGGPNLVS SFHVIG---E 1851 PEYVVFNGHV GAIAGDNALK AKAGETVRMY VGNGGPNLVS SFHVIG---E 1661 PLPNSLNTSY STVMVLSPAI TRKPKQAKPC VCTSVTAVRT ∗CLPSTSSAK 1759 PLPNSLNTSY STVMVLSPAI TRKPKQAKPC VCTSVTAVRT ∗C PSTSSAK L 1774 PEYVVFNGHV GAIAGDNALK AKAGETVRMY VGNGGPNLVS SFHVIG---E 1798 PEYVVFNGHV GAIAGDNALK AKAGETVRMY VGNGGPNLVS SFHVIG---E 1892 PEYVVFNGHV GAIAGDNALK AKAGETVRMY VGNGGPNLVS SFPRIG---E 1447 PEYVVFNGHV GSIAGDNALK AKAGETVRMY VGNGGPNLVS SFHVIG---E 1682 PEYVVFNGHV GAIAGDNALK AKAGETVRMY VGNGGPNLVS SFHVIG---E 1765 PEYVVFNGHV GSIAGDNALK AKAGETIRMY VGNGGPNLVS SFHVIG---E 1891 PEYVVFNGHV GSIAGDNALK AKAGETIRMY VGNGGPNLVS SFHVIG---E 149 159 169 179 187
197 207 217 227 237
MC58 IFDKVYVEGG KLINENVQST IVPAGGSAIV EFKVDIPGSY TLVDHSIFRA
N.l. IFDKVYVEGG KLINENVQST IVPAGGSAIV EFKVDIPGSY TLVDHSIFRA 100 IFDKVYVEGG KLINENVQST IVPAGGSAIV EFKVDIPGSY TLVDHSIFRA 1043 IFDKVYVEGG KLINENVQST IVPAGGSAIV EFKVDIPGSY TLVDHSIFRA 1200 IFDKVYVEGG KLINENVQST IVPAGGSAIV EFKVDIPGSY TLVDHSIFRA 1159 IFDKVYVEGG KLINENVQST IVPAGGSAIV EFKVDIPGSY TLVDHSIFRA 1332 IFDKVYVEGG KLINENVQST IVPAGGSAIV EFKVDIPGSY TLVDHSIFRA 1239 IFDKVYVEGG KLINENVQST IVPAGGSAIV EFKVDIPGSY TLVDHSIFRA 1284 IFDKVYVEGG KLINENVQST IVPAGGSAIV EFKVDIPGSY TLVDHSIFRA 297 IFDKVYVEGG KLINENVQAT K--- --- --- 1012 IFDKVYVEGG KLINENVQST IVPAGGSAIV EFKVDIQGSY TLVDHSIFRA 1857 IFDKVYVEGG KLINENVQST IVPAGGSAIV EFKVDIPGSY TLVDHSIFRA 1849 IFDKVYVEGG KLINENVQST IVPAGGSAIV EFKVDIPGSY TLVDHSIFRA 1851 IFDKVYVEGG KLINENVQST IVPAGGSAIV EFKVDIPGSY TLVDHSIFRA 1661 SSTKFMWKAA SLTKTYKAPS FLPAVP-PSS NSKSTSRAAT LWSTTPSSAH 1759 SSTKFMWKAA SLTKTYKAPS FLPAVP-PSS NSKSTSRAAT LWSTTPSSAH 1774 IFDKVYVEGG KLINENVQST IVPAGGSAIV EFKVDIPGSY TLVDHSIFRA 1798 IFDKVYVEGG KLINENVQST IVPAGGSAIV EFKVDIPGSY TLVDHSIFRA 1892 IFDKVYVEGG KLINENVQST IVPAGGSAIV EFKVDIPGSY TLVDHSIFRA 1447 IFDKVYVEGG KLINENVQST IVPAGGSAIV EFKVDIPGSY TLVDHSIFRA 1682 IFDKVYVEGG KLINENVQST IVPAGGSAIV EFKVDIPGSY TLVDHSIFRA 1765 IFDKVYVEGG KLINENVQST IVPAGGSAIV EFKVDIPGSY TLVDHSIFRA 1891 IFDKVYVEGG KLINENVQST IVPAGGSAIV EFKVDIPGSY TLVDHSIFRA
MC58 FNKGALGQLK VEGAENPEIM TQKLSDTAYA GNGAAPAASA PAASAPAASA
N.l. FNKGALGQLK VEGAENPEIM TQKLSDTAYA GNGAASAASA PAASAPAASA
100 FNKGALGQLK VEGAENPEIM TQKLSDTAYA GNGAAPAASA PAASAPAASA 1043 FNKGALGQLK VEGAENPEIM TQKLSDTAYA GNGAAPAASA PAASAPAASA 1200 FNKGALGQFK VEGAENPEIM TQKLSDTAYA GNGAAPAASA PAASAPAASA 1159 FNKGALGQLK VEGAENPEIM TQKLSDTAYA GNGAAPAASA PAASAPAASA 1332 FNKGALGQLK VEGEENPEIM TQKLSDTAYA GNGAAPAASA PAASAPAASA 1239 FNKGALGQLK VEGAENPEIM TQKLSDTAYA GNGAAPAASA PAASAPAASA 1284 FNKGALGQLK VEGEENPEIM TQKLSDTAYA GNGAASAASA PAASAPAASA 297A --- --- --- --- ---
1012 FNKGALGQLK VEGAENPEIM TQKLSDTAYA GNGAAPAASA PAASAPAASA 1857 FNKGALGQLK VEGAENPEIM TQKLSDTAYA GNGAAPAASA PAASAPAASA 1849 FNKGALGQLK VEGAENPEIM TQKLSDTAYA GNGAAPAASA PAASAPAASA 1851 FNKGALGQLK VEGAENPEIM TQKLSDTAYA GNGAAPAASA PAASAPAASA 1661 STKARWANKR VRKTLKSLKN VIPLTPVTVQ LLLLPLPQLL PRQPLHPKKA 1759 STKARWANKR VRKTLKSLKN VIPLTPVTVQ LLLLPLPQLL PRQPLHPKKA 1774 FNKGALGQLK VEGAENPEIM TQKLSDTAYA GNGAAPAASA PAASAPAASA 1798 FNKGALGQLK VEGAENPEIM TQKMSDTAYA GNGAAPAASA PAASAPAASA 1892 FNKGALGQLK VEGAENPEIM TQKLSDTAYA GNGAAPAASA PAASAPAASA 1447 FNKGALGQLK VEGAENPEIM TQKLSDTAYA GNGAAPAASA PAASAPA--- 1682 FNKGALGQLK VEGAENPEIM TQKLSDTAYA GNGAARAASA PAASAHAASA 1765 FNKGALGQLK VEGEENPEIM TQKLSDTAYA GNGAASAASA PAASAPAASA 1891 FNKGALGQL- VEGEENPEIM TQKLSDTAYA GNGAASAASA PAASAPAASA
MC58 SEKSVY N.l. SEKSVY 100 SEKSVY 1043 SEKSVY 1200 SEKSVY 1159 SEKSVY 1332 SEKSVY 1239 SEKSVY 1284 SEKSVY 297 --- 1012 SEKSVY 1857 SEKSVY 1849 SEKSVY 1851 SEKSVY 1661 LSSG- 1759 LTVR- 1774 SEKSVY 1798 SEKSVY 1892 PAKSDY 1447 --KSDY 1682 LAKSDY 1765 SEKSVY 1891 SEKSVY 294 304 314 324 334 344 354 364 374 384 390
Figura 12. Allineamento della sequenza aminoacidica della proteina AniA dei ceppi di N.
meningitidis di isolamento clinico, paragonandola alla sequenza di AniA del ceppo MC58. I
colori indicano : le mutazioni (giallo), le inserzioni (rosso), le delezioni (verde), il peptide segnale per il trasporto della proteina nel periplasma (sottolineato nel ceppo MC58), il sito di palmitolazione (grassetto), e i residui aminoacidici presenti nel sito di legame il rame di tipo I (blu) e di tipo II (rosa). Il sito catalitico istidina è colorato in verde. I ceppi non invasivi sono evidenziati in rosso. N. l.: Neisseria lactamica.
A
Indice di dissimilarità
B
Indice di dissimilarità
Figura 13. Dendrogrammi rappresentativi della sequenza nucleotidica (A) e aminoacidica (B) di AniA, ottenuti con il programma “Neighbor Joining tree”. I codici identificativi corrispondenti ai ceppi di N. meningitidis sono indicati sulla destra; MC58 è il ceppo di riferimento; N. lactamica è il ceppo commensale.
3.2 Clonaggio del dominio solubile di AniA
Il dominio solubile di AniA (sAniA) del ceppo di riferimento MC58 è stato ottenuto clonando la sequenza del gene corrispondente nel vettore di espressione batterica il plasmide pET28.
Inizialmente, sono stati selezionati i cloni di E. coli BL21 DE3 che esprimono maggiormente la sAniA, poi si è proceduti alla purificazione della proteina ricombinante, verificando la presenza di residui sequenziali di istidine. La proteina ricombinante, presentando la sequenza di sei istidine all’estremità C-terminale, si lega alla matrice della colonna di affinità tramite un legame di coordinazione tra la coda di istidine e il nichel della colonna. L’eluizione avviene in gradiente di imidazolo separando le proteine legate del lisato batterico, con un gradiente di concentrazione di imidazolo a seconda della forza del legame di coordinazione. Dall’analisi elettroforetica delle varie frazioni proteiche raccolte della cromatografia di affinità, la sAniA-His tag non eluisce in un unico picco del cromatogramma e ad una specifica concentrazione di imidazolo, ma viene staccata a partire da un tempo di ritenzione di circa 20 minuti corrispondente a circa 130mM di imidazolo, lungo tutto il gradiente. Dopo taglio dalla proteina ricombinante la coda di istidine che presenta all’estremità N-terminale il sito di riconoscimento per la trombina. In seguito, come ultimo step di purificazione è stata separata la trombina dall’AniA mediante cromatografia a scambio anionico in gradiente di NaCl e dall’analisi elettroforetica delle varie frazioni raccolte relative ai picchi del cromatogramma si deduce che l’AniA fluisce intorno ai 20min e la trombina, che si lega più fortemente alla resina fluisce intorno ai 63min.
Una volta purificata l’AniA, è stata effettuata una scansione spettroscopica nel visibile di sAniA con valori massimi di assorbimento a 458 e 585nm (figura 14).
Una frazione di sAniA è stata utilizzata per caratterizzare la proteina a livello biochimico e una frazione per immunizzare i conogli ed ottenere anticorpi policlonali anti-AniA.
Figura 14. Analisi dello spettro nel visibile di sAniA in tampone fosfato 20mM, pH=7. Lunghezza d’onda (nm)
3.3 Espressione di AniA in ceppi di isolamento clinico
L’espressione della proteina AniA in tutti i ceppi di meningococco esaminati è stata valutata dall’analisi del western-blotting, utilizzando il siero policlonale di coniglio ottenuto dopo immunizzazione con la sAniA clonata ed espressa in E. coli.
Tutti i ceppi di N. meningitidis contenenti le diverse alterazioni, delezioni e/o inserzioni, o il peptide segnale difettivo, esprimono la proteina, eccetto che due ceppi (1661 e 1759) per la presenza di un codone di stop all’interno del gene aniA (figura 15A). Nessuna proteina AniA è stata identificata come AniA in due ceppi di meningococco non invasivi in cui è stata trovata al posto del gene aniA una sequenza codificante una trasposasi parziale.
Per tutti gli altri ceppi, il livello di espressione della proteina mostrata è equiparabile a quello ottenuto per il ceppo di riferimento MC58 (figura 15B).
A
Figura 15. Western blotting della proteina AniA in ceppi di meningococco cresciuti in condizioni di microaerofilia.
MC58: ceppo di riferimento.
A) Linea 1) e 2) 100 e il 1857, (ceppi con sito di palmitolazione difettivo); Linea 3) 1332 (ceppo con mutazione H280L nel sito catalitico, inserzione di 9 aminoacidi vicino il sito del legame per il rame di tipo I); Linea 4) 1892 (ceppo con mutazioni H280P e V281R nel sito catalitico); Linea 5) 1661 (ceppo con codone di stop); Linea 6) 1759 (ceppo con codone di stop); Linea 7) 1159 (ceppo con possibile fallimento di localizzazione); Linea 8) 297 (ceppo con sequenza non completa della proteina); la posizione del dominio solubile dell’AniA purificata è indicata dalla freccia.