Dosaggio dei livelli di mieloperossidas

Negli animali di controllo, i livelli di MPO riscontrati nel digiuno e nell'ileo sono risultati rispettivamente pari a 6,7 e 3,0 ng/mg, (Figura 11A e B). Nel digiuno, il trattamento con indometacina, diclofenac o diclofenac più omeprazolo ha causato un aumento significativo del contenuto di MPO, mentre indometacina più omeprazolo, etoricoxib o celecoxib non hanno modificato in maniera significativa i livelli di MPO (Figura 11A). Al contrario, nell'ileo degli animali trattati con indometacina, indometacina più omeprazolo, diclofenac, diclofenac più omeprazolo o etoricoxib è stato osservato un aumento significativo dei livelli di MPO, mentre celecoxib non ha prodotto variazioni significative (Figura 11B).

66 A 0 10 20 30 40 M P O (n g/ mg d i te ss u to ) * * * DIGIUNO B 0 10 20 30 40 M P O (n g /m g d i t es su to ) * * * * * ILEO

Figura 11. Espressione dei livelli di mieloperossidasi (MPO) nel digiuno (A) e nell'ileo (B) nei ratti trattati con indometacina, indometacina più omeprazolo, diclofenac, diclofenac più omeprazolo, etoricoxib e celecoxib. Ogni colonna rappresenta la media±S.E.M. ottenuta da 6 animali. *P<0.05, differenza significativa vs controllo.

67 4.12 Analisi di correlazione

I dati ottenuti dall'espressione di COX-2 e dalla valutazione dei livelli di MPO ed MDA nell'ileo, sono stati analizzati mediante regressione lineare semi-log. Sull'asse delle y, sono stati riportati i valori dell'espressione di COX-2, intesa come variazione percentuale rispetto al valore di controllo, mentre sull'asse delle x, sono stati riportati i valori di MPO e MDA espressi come log delle variazioni percentuali verso i rispettivi valori di controllo. Correlazioni significative tra l'espressione di COX-2 con MPO (r2 = 0,944, p = 0,028) e MDA (r2 = 0,924, p = 0.038) sono state osservate negli animali trattati con indometacina, diclofenac, etoricoxib e celecoxib (Figura 12).

68 r2_{= 0.944} P= 0.028 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 -100 -50 0 50 100 150

MPO (Log % di variazione vs controllo)

C O X- 2 (% di v ar ia zi on e vs c on tr ol lo ) indometacina etoricoxib diclofenac celecoxib r2_{= 0.924} P= 0.038 1.0 1.5 2.0 2.5 -150 -100 -50 0 50 100 150

MDA (Log % di variazione vs controllo)

C O X -2 ( % d i va ri a zi o n e v s co n tr o llo ) indometacina diclofenac etoricoxib celecoxib A B

Figura 12. Analisi della regressione lineare tra l'espressione di COX-2 e i livelli tissutali di MPO (A) e MDA (B) negli animali trattati con indometacina, diclofenac, etoricoxib e celecoxib. Sull’asse y, sono stati riportati i valori dell'espressione di COX- 2, intesa come variazione percentuale rispetto al valore di controllo, sull'asse x, sono stati riportati i valori di MPO e MDA espressi come log delle variazioni percentuali verso i rispettivi valori di controllo.

69 5. DISCUSSIONE

Nonostante sia ampiamente riconosciuto che l’uso dei FANS si associ all’insorgenza di eventi avversi nel tratto gastrointestinale superiore, alcune evidenze sperimentali hanno suggerito che questi farmaci possano anche esercitare effetti negativi sul tratto gastrointestinale inferiore, con esiti potenzialmente gravi (perforazione, sanguinamento evidente e stenosi) (Scarpignato e Hunt, 2010; Zeino et al., 2010). L'uso cronico dei FANS è destinato principalmente ai pazienti anziani, per i quali l'età avanzata rappresenta uno dei principali fattori di rischio per lo sviluppo dell'enteropatia indotta da questi farmaci (Lanas et al., 2012). Alla luce di ciò, abbiamo scelto di condurre lo studio su un modello di animali anziani che rispecchiasse la pratica clinica. Infatti, è stato possibile osservare che il trattamento cronico con indometacina ha causato alterazioni a livello dell'intestino tenue come stenosi, lesioni erosive multiple, e una diminuzione dei livelli di emoglobina nel sangue, in maniera analoga a quanto osservato in pazienti sottoposti a trattamento con FANS (Nygård et al., 1995; Maiden et al., 2005).

Inoltre, la somministrazione di FANS è risultata in grado di influenza la funzione mitocondriale, in accordo con quanto osservato da Somasundaram et al. (2000), dove indometacina ha dimostrato di

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contrastare il trasporto degli elettroni lungo la catena respiratoria nei mitocondri epatici di ratto in vitro. Nei nostri esperimenti, lo stesso farmaco, non ha avuto alcuna influenza sugli indici della funzionalità mitocondriale, ma ha aumentato la sensibilità dei mitocondri agli agenti disaccoppianti, probabilmente come conseguenza del trattamento cronico.

Come previsto, il trattamento con diclofenac ha causato alterazioni macroscopiche del piccolo intestino e una diminuzione dei livelli di emoglobina nel sangue. L'analisi istologica ha evidenziato che indometacina e diclofenac hanno causato lo sviluppo sia di lesioni intestinali più superficiali che più profonde. Inoltre, indometacina e diclofenac hanno provocato un aumento dello stress ossidativo, dell'infiltrato infiammatorio e alterazioni mitocondriali, suggerendo che lo sviluppo di enteropatia sia dovuto ad un effetto diretto sulla parete intestinale. Tuttavia, nei ratti trattati con ns-FANS è stata osservata una diminuzione dei livelli di PGE2 intestinale, un effetto non condiviso da

celecoxib e etoricoxib. Pertanto, il blocco della COX-1 causato da indometacina e diclofenac, e la conseguente riduzione della produzione di prostaglandine, potrebbe contribuire all'evolversi dell'enteropatia.

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Nei nostri esperimenti, celecoxib si è dimostrato molto meno lesivo rispetto ai ns-FANS. Infatti, gli animali trattati con celecoxib non hanno riportato evidenti alterazioni macroscopiche intestinali e/o riduzione dei livelli di emoglobina nel sangue. Inoltre, celecoxib non ha provocato lesioni profonde di tipo 3, mentre ha causato un basso grado di sviluppo di lesioni di tipo 2, ed alcune erosioni di tipo 1. Inoltre, celecoxib non ha modificato in maniera significativa i livelli di ossidazione dei tessuti intestinali, dell’infiltrato infiammatorio e della funzione mitocondriale, e non ha influenzato la produzione di PGE2. Le nostre osservazioni sono in

accordo con quanto osservato nell'uomo, in cui il trattamento cronico con celecoxib ha dimostrato una buona tollerabilità intestinale (Goldstein et al., 2005; Goldstein et al., 2007; Chan et al., 2010). Inoltre, questi dati sono in linea con il profilo farmacodinamico e le caratteristiche chimico-fisiche di celecoxib, il quale è caratterizzato da un elevato valore di pKa e quindi sprovvisto di proprietà acide (Gierse et al., 2005). Studi pre-clinici (Tibble et al., 2000; Menozzi et al., 2006) e uno studio clinico (Smecuol et al., 2001), hanno dimostrato l'incapacità di celecoxib ad influenzare la permeabilità intestinale, il cui incremento rappresenta la chiave fisiopatologica per la formazione delle lesioni (Bjarnason e Takeuchi, 2009). Inoltre, è stata dimostrata l'incapacità di

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celecoxib di alterare la fosforilazione ossidativa mitocondriale (Tibble et al., 2000), considerata come un fattore che contribuisce all’alterazione dell’integrità della barriera intestinale, e quindi allo sviluppo di enteropatia.

Etoricoxib ha dimostrato un profilo di tollerabilità migliore rispetto a indometacina e diclofenac, ma meno favorevole rispetto al celecoxib. Nel gruppo di animali trattati con etoricoxib, alcuni ratti hanno sviluppato ulcerazioni macroscopiche. Inoltre, etoricoxib ha indotto lo sviluppo di lesioni di tipo 2 e 3, soprattutto nell'ileo. Tuttavia, queste lesioni non sono risultate associate ad una riduzione significativa di emoglobina nel sangue, che sembra coerente con la mancanza di perdita di sangue nelle feci in pazienti trattati con etoricoxib (Hunt et al., 2003). Per quanto riguarda i meccanismi alla base dell'enteropatia causata da etoricoxib, i nostri dati suggeriscono un'azione topica diretta. Infatti, negli animali trattati con etoricoxib è stato osservato un incremento dello stress ossidativo, dell’infiltrazione infiammatoria intestinale e alterazioni mitocondriali epatiche, ma nessuna variazione della produzione di PGE2 intestinale. Etoricoxib, oltre ad aumentare la

sensibilità mitocondriale agli agenti disaccoppianti, è stato l'unico farmaco in grado di influenzare i complessi respiratori mitocondriali e

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l'integrità della membrana interna, come indicato dai valori RCR. Tale effetto, non sembra probabilmente correlato con il suo profilo di selettività, in quanto, nonostante etoricoxib sia più selettivo per COX-2 rispetto celecoxib (Riendeau et al., 2001), nei nostri esperimenti quest'ultimo si è dimostrato privo di qualsiasi effetto sulla attività mitocondriale e non ha aumentato gli indici del danno ossidativo e delle lesioni infiammatorie nei tessuti intestinali. Pertanto, le differenze osservate tra i profili di tollerabilità intestinale di etoricoxib e celecoxib possono essere spiegate considerando che, a differenza di celecoxib, etoricoxib è caratterizzato da una basso pKa, come la maggior parte dei ns-FANS (Paulson et al, 2001;. Michaux e Charlier, 2004). I nostri dati pre-clinici, sono in accordo con i risultati di un programma di studi clinici (MEDAL), in cui i pazienti hanno sviluppato un grado di tossicità intestinale simile in seguito al trattamento con etoricoxib o diclofenac (Laine et al., 2007).

L'analisi Western blot, effettuata sui campioni di ileo ottenuti dai ratti di controllo, ha evidenziato l'espressione di entrambe le isoforme di COX. L'espressione di COX-1 non è stata influenzata da nessuno dei farmaci in studio, mentre quella di COX-2 è risultata aumentata nel gruppo di animali trattati con indometacina, diclofenac ed etoricoxib,

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mentre è risultata diminuita nel gruppo di animali trattati con celecoxib. L’andamento dell'espressione di COX-2 è parzialmente coerente con l’entità del danno enterico causato dai farmaci, in quanto è stata osservata una buona correlazione tra gli effetti lesivi infiammatori indotti dai farmaci in studio (come risultato dell’andamento dei valori di MPO e MDA nei tessuti) e le rispettive variazioni di espressione di COX- 2. Nel complesso, le variazioni dell'espressione di COX-2 a livello dell’ileo, riflettono la capacità di questi farmaci di indurre effetti lesivi topici sulla parete. Infatti, mentre indometacina, diclofenac ed etoricoxib, responsabili di notevoli lesioni intestinali, hanno anche determinato un'induzione significativa di COX-2, celecoxib, risultato privo di effetti lesivi significativi, non ha portato ad un aumento dell'espressione di COX-2. Sebbene sia stato osservato che l'inibizione concomitante di COX-1 e COX-2 sia necessaria per indurre lo sviluppo di lesioni intestinali (Takeuchi et al., 2010), i risultati del nostro studio hanno prodotto evidenze discordanti, in quanto etoricoxib è risultato in grado di provocare effetti lesivi intestinali nonostante il suo profilo di selettività verso COX-2.

Nel presente studio, alcuni gruppi di animali sono stati trattati con indometacina o diclofenac in associazione ad omeprazolo, in modo da

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riflettere la situazione clinica, dove gli effetti degli inibitori selettivi di COX-2 sono stati confrontati con quelli dei ns-FANS più IPP (Chan et al., 2010; Combe et al., 2009). I risultati ottenuti si sono rivelati particolarmente interessanti. Infatti, l’IPP si è dimostrato apparentemente protettivo nei confronti dell'azione lesiva di indometacina nel digiuno ma non nell'ileo (in particolare nel caso di lesioni di tipo 2 e 3). Al contrario, omeprazolo associato a diclofenac ha esacerbato l'azione del FANS sia nel digiuno che nell'ileo, in particolare aumentando l’entità delle lesioni di tipo 2 e 3. Entrambe le nostre osservazioni, se pur in conflitto tra loro, risultano corroborate dai dati riportati in letteratura. Infatti, in uno studio condotto su un modello murino, Kuroda et al. (2006) hanno osservato che lansoprazolo ha contrastato il danno intestinale indotto da indometacina, mentre Wallace et al. (2011) e Satoh et al. (2012) hanno osservato che alcuni IPP esacerbano gli effetti lesivi di naprossene e indometacina sull' intestino tenue del ratto. In ambito clinico, Goldstein et al. (2005) e Hawkey et al. (2008) hanno osservato un aumento dell’incidenza di lesioni intestinali in volontari sani che assumevano naprossene in combinazione con omeprazolo. Inoltre, Watanabe et al. (2013) hanno recentemente dimostrato che gli IPP risultano in grado di aggravare le

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lesioni nell’intestino tenue di pazienti affetti da artrite reumatoide e sottoposti a trattamento cronico con FANS. In generale, sembra quindi che la gravità del danno sulla parete intestinale dipenda dal tipo di FANS, dal tipo di IPP considerati, dal modello sperimentale scelto e dal regime di trattamento con IPP adottato. Tuttavia, non è possibile trarre conclusioni certe sull'influenza che gli IPP esercitano sull'enteropatia indotta da FANS, e sono necessarie ulteriori studi per chiarire questo aspetto.

In conclusione, i dati ottenuti dal presente studio mostrano che la somministrazione cronica di ns-FANS così come di etoricoxib, caratterizzati da un basso valore di pKa, possono indurre lo sviluppo di enteropatia, attraverso effetti topici diretti sulla mucosa. Al contrario celecoxib, sprovvisto di caratteristiche acide, risulta privo di azioni lesive significative sul piccolo intestino. Pertanto, la sola inibizione di COX-1 e/o COX-2, non sembra essere sufficiente a provocare un danno intestinale in assenza di effetti lesivi topici, come documentato anche dal diverso impatto che celecoxib ed etoricoxib possiedono sugli indici di ossidazione, infiammazione e funzione mitocondriale.

77 6. BIBLIOGRAFIA

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