Elettroforesi tradizionale vs separazione microfluidica automatizzata per la

La metodica sAFLP si è rivelata utile per la caratterizzazione molecolare di L. monocytogenes, in accordo con altri studi [138; 139]. Tuttavia, analogamente ad altre tecniche basate su restrizione enzimatica, risulta piuttosto laboriosa e necessita di lunghi tempi di esecuzione. Per ovviare, in parte, a tali limitazioni è stata valutata la possibilità di sostituire la tradizionale elettroforesi con tecnologie innovative per la separazione degli acidi nucleici. Infatti, la sAFLP prevede una fase finale della durata di oltre 4 ore per l’ottenimento dei profili di restrizione, basata su separazione in gel di agarosio. Mediante l’utilizzo di chip per l’elettroforesi microfluidica, tale passaggio può essere realizzato in maniera automatizzata in circa 40 minuti ed è completamente evitato l’utilizzo di bromuro di etidio. Il risultato è infatti fornito sotto forma di elettroferogramma, convertito automaticamente dal software in gel virtuale.

L’indagine condotta su un sottogruppo rappresentativo di ceppi di L. monocytogenes ha evidenziato una totale congruenza nella struttura del dendrogramma dei profili di elettroforesi su gel virtuale e quello ottenuto dall’analisi su gel di agarosio. Entrambe le tecniche hanno, inoltre, mostrato un elevato potere discriminante. Tutti i ceppi appartenenti alla linea genetica I

sono stati separati da quelli della lineage II e i sottogruppi individuati in questi due grandi cluster hanno incluso esattamente gli stessi ceppi. È stata osservata una totale concordanza con i dati di sierotipizzazione, poiché sono stati ottenuti cluster distinti per ciascun sierotipo e gli isolati sono stati separati anche in accordo al profilo RFLP di inlA. I ceppi risultati geneticamente simili o che hanno mostrato un livello di similarità superiore al 90% sono stati gli stessi con entrambe le tecniche. L’elettroforesi microfluidica ha evidenziato una maggiore risoluzione nella visualizzazione di doppie bande (doppio picco nell’elettroferogramma), non visibili in gel di agarosio, o di bande di basso peso molecolare, per le quali è stata necessaria un’ulteriore colorazione del gel in soluzione di bromuro di etidio.

Quindi, l’utilizzo del sistema di elettroforesi microfluidica, oltre a ridurre i tempi di analisi, consente un’identificazione più accurata delle bande caratterizzanti il profilo sAFLP. La sostituzione del gel di agarosio con quello virtuale consente di ridimensionare l’errore nella clusterizzazione dei ceppi legato a fenomeni di distorsione della corsa elettroforetica su gel di agarosio. Infatti, per alcuni dei 250 ceppi analizzati mediante sAFLP è emersa un’incongruenza rispetto all’osservazione visiva dei profili e ceppi con pattern di restrizione identico sono stati inclusi in cluster differenti ed è stato necessario correggere l’errata interpretazione. Il gel virtuale, ottenuto in maniera automatizzata e standardizzata, non risente di tale difetto di interpretazione, anche grazie all’introduzione in ciascuna prova della miscela di 1K e 12K ladder, che migliora notevolmente l’allineamento delle bande mediante software Bionumerics [17]. Questo studio preliminare ha confermato la possibilità di combinare la sAFLP con chip per l’elettroforesi microfluidica. Il sistema automatizzato Experion™ si è rivelato altamente sensibile ed accurato, permettendo di utilizzare quantità inferiori di reagenti e di campione (1 µl di DNA). Inoltre, consente la riduzione del rischio chimico per gli operatori, in quanto evita l’impiego di reagenti tossici e/o cancerogeni. Infine, la completa automazione garantisce una maggiore riproducibilità dei risultati finali e la presenza di condizioni analitiche costanti. L’introduzione di tale sistema elettroforetico, per una più rapida ed accurata tipizzazione dei microrganismi, rappresenta un’evoluzione della metodica tradizionale con una sensibile riduzione dei tempi di analisi. In combinazione con la sAFLP costituisce, pertanto, un valido supporto per la tipizzazione molecolare di L. monocytogenes.

7.2 Standardizzazione di un saggio in Real-time Multiplex-PCR per la sierotipizzazione molecolare di L. monocytogenes

La tipizzazione dei ceppi di L. monocytogenes risulta fondamentale per la sorveglianza delle infezioni sostenute dal patogeno, a causa della differente rilevanza clinica dei sierotipi all’interno della specie. Attualmente, la caratterizzazione di L. monocytogenes viene condotta su due livelli, determinando il sierotipo attraverso sierotipizzazione convenzionale o con metodi molecolari alternativi denominati PCR-serogrouping e applicando il metodo di riferimento Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) [130; 131; 160; 161].

L’individuazione convenzionale dei sierotipi, basata su test di agglutinazione, è ancora necessaria come primo livello per la caratterizzazione di casi sospetti di L. monocytogenes. Tuttavia, recenti metodi molecolari permettono di superare i limiti di tale metodica, tra cui elevato costo dei reagenti, lunghi tempi di analisi e soprattutto complessità e soggettività nell’interpretazione dei risultati dovuta a fattori di confondimento, che rendono spesso difficile e non definita l’assegnazione del sierotipo. Essendo, inoltre, la PFGE molto laboriosa, le metodiche basate su PCR per l’individuazione dei sierogruppi possono rappresentare la strategia di elezione per un rapido screening iniziale nelle indagini epidemiologiche [132]. La procedura di identificazione dei sierogruppi in Real-time PCR, messa a punto e standardizzata in questo studio, ha fornito risultati concordanti con il precedente schema molecolare di Doumith et al. (2004) [131], che rappresenta uno dei metodi più utilizzati per la sorveglianza epidemiologica dei ceppi circolanti del patogeno. Il nuovo approccio sviluppato per la sierotipizzazione molecolare di L. monocytogenes ha permesso di classificare correttamente i ceppi nei rispettivi sierogruppi di appartenenza. In particolare, tutti gli isolati di sierotipo 1/2a e 3a sono stati raggruppati nel Gruppo I, i ceppi 1/2c e 3c nel Gruppo II, gli isolati 1/2b, 3b e 7 nel Gruppo III e i sierotipi 4b, 4d e 4e nel Gruppo IV. Inoltre, ha permesso di identificare anche gli isolati di sierotipo 4b caratterizzati da un profilo atipico, derivato presumibilmente dalla combinazione tra ceppi 1/2a e 4b, identificati nel 2007 in Francia e successivamente in altre aree geografiche di Stati Uniti, Cile e Australia, ai quali al momento non risulta associato nessun evento epidemico di listeriosi [132; 160].

A differenza della sierotipizzazione tradizionale, il metodo molecolare non permette l’individuazione del singolo sierotipo. Tuttavia, dal punto di vista epidemiologico, tale aspetto è di secondaria importanza, in quanto i sierotipi 3a, 3b, 3c, 4a, 4c, 4e, 4d e 7 risultano estremamente rari, al contrario dei ceppi 1/2a, 1/2b, 1/2c e 4b correntemente isolati nella maggior parte degli alimenti contaminati e nei casi clinici di listeriosi. Di conseguenza, l’individuazione dei sierogruppi mediante Real-time PCR può ragionevolmente sostituire la

sierotipizzazione convenzionale basata su reazione di agglutinazione, a vantaggio del risparmio economico e soprattutto della tempestività e dell’attendibilità del risultato finale.

Lo schema di tipizzazione proposto in questo studio permette un’ulteriore riduzione dei tempi di analisi rispetto al metodo molecolare di riferimento, non essendo richiesta la fase finale di separazione elettroforetica dei prodotti di PCR su gel di agarosio ed eliminando completamente l’eventuale impiego di reagenti tossici.

La sostituzione della tradizionale PCR end point prevista dal protocollo di riferimento, con un saggio in Real-time PCR, rappresenta un’evoluzione della sierotipizzazione, a cui si accompagna un significativo miglioramento delle performance del metodo. L’utilizzo di sonde TaqMan garantisce, un’aumentata specificità, con un minor rischio di prodotti di reazione aspecifici, in quanto l’emissione del segnale di fluorescenza da parte del fluoroforo reporter si verifica solo a seguito del legame contemporaneo degli inneschi oligonucleotidici e della rispettiva sonda ad ibridazione con la sequenza genomica target.

Alla maggiore specificità di reazione si aggiunge anche una maggiore sensibilità del metodo, in quanto il sistema di rilevamento e di misurazione in tempo reale del DNA amplificato consente di individuare anche minime quantità di DNA, con un intervallo di quantificazione più ampio. Oltre alla classificazione in sierogruppi, la sierotipizzazione molecolare consente di discriminare tra ceppi di L. monocytogenes ed isolati appartenenti ad altre specie del genere

Listeria spp., mediante l’amplificazione del gene prs. Tale gene risulta assente in L. rocourtiae,

specie identificata solo nel 2010 e comunque non patogena per l’uomo [27]. Inoltre, l’utilizzo di primers e rispettiva sonda per l’identificazione del gene plcA permette di avere un’ulteriore conferma dell’appartenenza degli isolati alla specie L. monocytogenes.

Tale aspetto si dimostra utile dal punto di vista tecnico, in quanto il segnale di amplificazione di prs nella Triplex-PCR 2 risulta poco efficiente nel caso di ceppi di sierogruppo I, II o sierotipo 4b atipici. Tale difficoltà risulta trascurabile grazie alla contemporanea amplificazione del gene plcA, che assolve, in tal caso, alla stessa funzione del gene prs. L’introduzione di tale target nel saggio si rileva utile anche per evitare un’errata identificazione di specie non-monocytogenes che, tuttavia, presentano sequenze geniche in comune con i geni target della sierotipizzazione.

Ad esempio, è stato osservato che sia L. monocytogenes sia L. seeligeri condividono i sierotipi 1/2a, 1/2b, 3b, 4a, 4b, 4c e 6b, per cui la sierotipizzazione potrebbe in alcuni casi non identificare correttamente la specie [14]; oppure, come verificato in questo studio, altre specie potrebbero condividere sequenze geniche altamente simili ai target molecolari selezionati, come il gene ORF2110 in L. seeligeri. Inoltre, in alcuni isolati di L.monocytogenes è stato dimostrata la presenza del gene specie-specifico Lin0464 di L. innocua, suggerendo che il

trasferimento orizzontale di geni e la ricombinazione genetica sono eventi probabili all’interno delle specie di Listeria spp. [132].

Unica limitazione del metodo proposto rispetto a quello di riferimento consiste nella mancata amplificazione del gene prs in L. grayi; ceppi appartenti a questa specie risultano, quindi,

classificati come non appartenenti a Listeria spp. Tuttavia, tale specie non è patogena per l’uomo ed è isolata raramente da prodotti alimentari. Inoltre, alcuni studi hanno messo in evidenza un’elevata distanza genetica di L. grayi rispetto alle altre specie, suggerendo l’ipotesi dell’appartenenza ad un nuovo genere denominato Murraya [26].

In conclusione, il nuovo approccio di sierotipizzazione molecolare, basato sulla combinazione di due Triplex-PCR con utilizzo di sonde TaqMan, potrebbe essere utilizzato di routine nella sorveglianza epidemiologica del patogeno, in quanto consente l’univoca identificazione di

L.monocytogenes e contemporaneamente l’assegnazione del sierogruppo di appartenenza, in un

unico saggio in Real-time PCR. Il metodo si dimostra altamente specifico, riproducibile, sensibile, semplice e rapido, per cui può contribuire ad un’accurata identificazione dei sierotipi circolanti e all’implementazione delle misure per il controllo delle infezioni.