Enzimi di patogenes

Allo scopo di valutare alcuni degli eventuali enzimi di patogenesi (poligalatturonasi, pectin liasi, cellulasi e proteasi), i 20 ceppi di F. solani f. sp. cucurbiate sono stati coltivati in terreno liquido povero di elementi nutritivi (Pratt’s Medium modificato), addizionato di pareti cellulari vegetali estratte dal colletto di piante di melone.

Estrazione della pareti cellulari

L’estrazione delle pareti cellulare è stata ottenuta seguendo un metodo già noto (Rose et al., 1998; Huysamer et al., 1997; Brummell et al., 1997),

I = i=1 n

∑(ni · vi) · 100 N · V

modificato. Porzioni di colletto di piante di melone precedentemente sminuzzate sono stata bollite in 100 ml di etanolo (95%) per 30-45 minuti, applicando sul bollitore una colonna di raffreddamento per la condensazione e il recupero dei vapori di etanolo. Il tessuto vegetale è stato poi raffreddato, omogeneizzato e filtrato con pompa a vuoto e filtro poroso in vetro (Nuclepore) ricoperto in superficie con una membrana di carta (Whatman 1001 055). E’ stato così recuperato il materiale vegetale insolubile che è stato poi sottoposto a tre cicli di lavaggio e di filtrazione. Il primo lavaggio è stato eseguito usando 100 ml di etanolo (95%), il secondo con 100 ml di cloroformio: metanolo (1:1 v/v), il terzo con 100 ml di acetone. Dopo ogni lavaggio il campione è stato posto in agitazione per 5 minuti e filtrato. Il materiale è stato poi asciugato in stufa a 30°C per una notte, posto in un contenitore ermetico e congelato. Sono state ottenuti 3,5 g di parete cellulare da 128 g di materiale vegetale fresco.

Estrazione degli enzimi del patogeno

Per ognuna delle 20 colonie monosporiche è stato preparata una beuta contenente 20 ml di un substrato liquido di crescita Pratt’s, in accordo con Quadir et al. (1997) così composto: K2PO4, 13,6 g/L; NH4NO3,4,0 g/L;

MgSO4x7H2O, 1,25 g/L; CuSO4 x 5H2O, 0,001 g/L; ZnSO4x7H2O, 0,002

g/L; (NH4)2MoO4, 0,0013 g/L; MmSO4xH2O, 0,016 g/L; H3BO3, 0,028

g/L; FeSO4x7H2O, 0,02 g/L; estratto di lievito, 1,0 g/L; pareti cellulari

vegetale, 3,0 g/L; H2O, 1,0 L; pH 4,5. Il substrato è stato quindi inoculato

con un plug di 4 mm di diametro di micelio di ciascun ceppo del patogeno e posto ad agitare alla temperatura di 26°C, per 14 giorni.

Dopo l’incubazione di 14 giorni ogni beuta è stata filtrata con triplo strato di garza sterile, centrifugata per 10 minuti a 4000 rpm a 15°C e filtrata nuovamente con filtri sterili di 0,45 µm. I filtrati ottenuti sono stati dializzati immergendo una membrana selettiva Spectra/Por Membrane MWCO: 6-8,000 (Spectrum; Reorder n° 132 650), contenente ciascun filtrato in un tampone composto da 3,6 L di acqua distillata sterile a pH 7 e 0,4 L di sodio acetato 1M a pH 5 e posto in agitazione a 4°C per 16 ore. I

filtrati colturali dializzati sono stati trasferiti in Falcon sterili e conservati a -20°C fino al loro utilizzo per i test di attività enzimatica su substrato solido (Cup Plate).

Determinazione dell’attività enzimatica

E’ stato utilizzato il metodo del Cup Plate che permette di evidenziare l’attività di un enzima con la formazione di un alone trasparente su gel colorato. Le caratteristiche dei gel e dei coloranti variano in funzione dell’enzima ricercato. I substrati solidi sono stati preparati seguendo il protocollo modificato di Hankin e Anagnostakis (1975). Per stabilire lo standard di riferimento quantitativo sono stati eseguiti i test utilizzando enzimi noti di provenienza commerciale, da questi sono state ottenute le curve di taratura.

Attività poligalatturonasica (PG)

Le poligalatturonasi è stata determinate in accordo con Tamura et al. (2004), Stotz et al. (1993), Hankin et al. (1975) e Chattrjee (1995) e opportune modifiche.

Una soluzione contenente 2 g agarosio, 20 mg acido poligalatturonico e 200 ml acetato di sodio 0,1 M pH 5 e 0,744 g di EDTA è stata portata ad ebollizione e versata ancora calda in una piastra trasparente in grado di contenere, una volta raffreddato, un gel alto circa 2 mm. Una volta solidificato il gel è stato forato con foratappi del diametro di 6 mm creando così dei pozzetti equidistanti che sono stati riempiti con 40 µl del campione da analizzare. La piastra è stata incubata a 37°C per 16 ore e il gel è stato poi colorato con Ruthenium Red (0,05 w/v; 0,2g/400ml acqua distillata) per 30 minuti in agitazione avendo cura che la superficie del gel fosse bagnata omogeneamente dalla soluzione colorante. Al termine della colorazione il gel è stato lavato per circa 20 minuti con acqua distillata. Un gel analogo è stato fatto per determinare l’attività dello standard di riferimento utilizzando la Pectinasi da Aspergillus niger (Sigma P2736, Ferment Depectinization Unit – FDU – 3,093 FDU/ml). Differenti

concentrazioni dell’enzima, da 0 a 10 %, sono stati caricati in triplice coppia, ponendo sempre 40 µL per foro.

La presenza di enzimi pectolitici nei campioni è stata evidenziata da un alone trasparente su sfondo rossastro.

Attività pectin liasica (PL)

Le pectin liasi sono state determinate in accordo con Hankin et al. (1975) e Chattrjee (1995), con modifiche. Il procedimento adottato nella preparazione del gel è lo stesso di quello usato per gli enzimi pectolitici, con l’unica differenza nel pH dell’acetato che in questo caso è stato portato a 7. La composizione del gel pertanto è stata la seguente: 2 g di agarosio, 20 mg di acido poligalatturonico e 200 ml di acetato di sodio 0,1 M pH 7. Un gel analogo è stato preparato per determinare lo standard di riferimento utilizzando la pectato liasi da Cellvibrio japonicus (Megazyme E-PLYCJ). Differenti concentrazioni dello standard ( da 0,68 a 18,04 U/ml) sono stati caricati in triplice coppia, ponendo 40 µL per foro.

La quantità di campione caricato, il tempo di incubazione e il tipo di colorazione è stato lo stesso di quello usato per rilevare la pectinasi.

Attività cellulasica (CMC)

La cellulasi è stata determinate in accordo con Burianova et al.(1991), con modifiche. La composizione del gel utilizzato per saggiare l’attività delle cellulasi è stato il seguente: 2 g di agarosio, 0,2 g di carboxymethilcellulase (CMC) e 200 ml di fosfato di sodio 0,1 M pH 5,5. Una volta caricati i campioni, il gel è stato incubato per 16 ore a 37°C. Successivamente è stato colorato con una soluzione di Congo Red (0.1 % w/v) per 30 minuti. La superficie del gel è stata poi lavata per due volte con una soluzione di cloruro di sodio 1 M. Per incrementare il contrasto il gel è stato lavato con acido acetico (5%) per 3 minuti. La presenza di enzimi cellulosolitici, nei campioni è stata evidenziata dalla presenza di un

alone trasparente su sfondo scuro. Un gel analogo è stato allestito per determinare lo standard di riferimento utilizzando la cellulasi da

Aspergillus sp. (Sigma C2605).

Differenti concentrazioni dell’enzima, da 0 a 10 %, sono stati caricati in triplice coppia, ponendo sempre 40 µl per foro. Il caricamento dei campioni e l’incubazione sono stati i medesimi della Pectinasi.

Attività proteasica (PR)

La cellulasi è stata determinate seguendo il metodo di Gregori et al. (2003) modificato. I campioni di estratto enzimatico provenienti dai 20 ceppi sono stati caricati come nei precedenti saggi su gel composto da: 2 g di agarosio, 2 g di gelatina o caseina, 200 ml di acetato di sodio 0,1 M pH 5, incubato per 16 ore a 37°C. Il gel è stato poi colorato con una soluzione di Comassie Brilliant Blue per 3 ore. Tale soluzione era composta da: Comassie Brilliant Blue, 0,5 g; acqua distillata pH 7, 90 ml; metanolo, 90 ml; acido acetico glaciale, 20 ml. La superficie del gel è stata decolorata con acqua per circa un’ora, per tre volte. La presenza di enzimi proteolitici nei campioni, è stata evidenziata dalla presenza di un alone trasparente nel gel su sfondo scuro. Un gel analogo è stato fatto per determinare lo standard di riferimento utilizzando la pepsina (Pepsin A Sigma P7000).

2.3 ATTIVITÀ DI PRODOTTI BIOLOGICI SULLA