Esperimenti comportamentali

Gli animali sperimentali sono stati catturati con bertovelli ad esca nell’area delle Cascine di Tavola e del Lago Ombrone (PO) e nell’oasi delle Querciola a Sesto Fiorentino (FI) nel mese di maggio, ovvero prima dell’inizio della stagione riproduttiva. Questo accorgimento ha

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consentito la cattura di individui con una bassa probabilità di essersi accoppiati prima delle osservazioni comportamentali e quindi in grado di esprimere la massima recettività ai potenziali stimoli feromonali in fase sperimentale (Aquiloni & Gherardi 2010). Gli esemplari catturati (circa 300 tra maschi e femmine di Procambarus clarkii) sono stati immediatamente trasportati in laboratorio e divisi per genere in vasche di stabulazione in 108 litri di acqua (120 x 60 cm; acqua 15 cm) dotate di rifugi artificiali e sottoposte ad un ciclo naturale luce-buio. Gli animali sono stati nutriti ogni giorno ad libitum con larve di Calliphora sp. e le vasche sono state regolarmente pulite dopo il pasto. Per entrambi i sessi, solo gli individui adulti con entrambe le chele e tutte le appendici locomotorie intatte sono stati utilizzati nelle successive fasi sperimentali, assicurandosi che i maschi fossero tutti di tipo riproduttivo (Forma I). Da questo gruppo sono stati successivamente prelevati a caso 25 maschi sperimentali e trasferiti in acquari individuali (28 x 20 x 18 cm). Ad ogni maschio è stata misurata la lunghezza del cefalotorace con un calibro (accuratezza 0.1 mm) (Maurer) per verificare, a posteriori, la rappresentatività del campione selezionato. Come atteso, la taglia degli animali sperimentali è risultata analoga alla taglia della popolazione maschile pescata (47.54±0.53 vs 46.6±0.72; t=0.500, df=128 P= 0.617).

Prima dell’inizio degli esperimenti, i maschi sono stati osservati ogni giorno per capire la loro disponibilità all’accoppiamento inserendo nel loro acquario una femmina sessualmente riproduttiva di dimensioni adeguate (Aquiloni and Gherardi, 2008). Quando il maschio manifestava il classico display di accoppiamento, era trasferito in un acquario sperimentale (35 x 23 x 22 cm) e mantenuto in completo isolamento per una settimana in modo da eliminare l’esperienza sociale pregressa prima delle osservazioni comportamentali (Hemsworth et al., 2007). L’apparato sperimentale consisteva in 25 acquari, uno per ciascun maschio, disposti in batteria e identificati con un numero. Gli acquari erano visivamente isolati uno dall’altro con lamine in plexiglass opaco e riempiti con 5.5 litri d’acqua che raggiungeva un livello di 7 cm, in modo che gli animali vi fossero completamente immersi ma le loro antenne ne toccassero la superficie. In ogni acquario era inserito un rifugio artificiale disposto dalla parte opposta alla zona di rilascio dello stimolo. Il rifugio aveva due funzioni importanti: la prima era ospitare l’animale in riposo riducendone lo stress dovuto alla lunga permanenza in laboratorio, la seconda era fornire un’alternativa allo stimolo che aiutasse a discriminare tra una locomozione disordinata, legata al disagio di occupare uno spazio limitato in un contesto non naturale, e una orientata e scatenata dallo stimolo.

Il saggio in vivo consisteva in osservazioni del comportamento in due fasi successive: (1) una fase di controllo in cui 20 mL di soluzione fisiologica erano rilasciati per mezzo di una

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siringa sterile nell’acqua nel lato opposto dell’acquario rispetto a quello occupato dalla tana e (2) una fase sperimentale in cui erano somministrati, con la stessa modalità della fase di controllo, 20 mL di soluzione di trattamento (fisiologica e pool fagico). Nei test di controllo anche durante la seconda fase veniva somministrata la sola soluzione fisiologica. Il comportamento era osservato in ciascuna delle due fasi per tre minuti (tempo sufficiente nei gamberi a mostrare eventuali alterazioni del comportamento in risposta ad uno stimolo; vedi Acquistapace et al. (2002) a partire dalla prima reazione dell’animale test. Il tempo intercorso tra il rilascio della soluzione e la prima reazione dell’animale è stato registrato come tempo di latenza. Quando il tempo di latenza superava i 15 minuti, il test era interrotto e la risposta allo stimolo considerata nulla. Analogamente ad Aquiloni et al. (2009), per assicurarsi che la manipolazione prevista dal protocollo sperimentale per la somministrazione delle soluzioni non disturbasse gli animali test, è stato condotto un test preliminare di controllo utilizzando la stessa procedura descritta sopra ma rilasciando in entrambe le fasi solo soluzione fisiologica. I parametri raccolti in ciascuna fase dei test preliminari, sperimentali e del controllo erano:

(1) la locomozione (in secondi), il cui cambiamento di direzione e intensità denota la percezione di stimoli (Acquistapace et al., 2002), distinguendo tra locomozione orientata verso il punto di rilascio dello stimolo e locomozione non orientata;

(2) il movimento antennale (in secondi) distinguendo tra il movimento delle antenne o delle antennule; entrambi questi movimenti sono infatti legati all’attività di esplorazione/ricerca: le antenne vengono utilizzate prevalentemente con funzione tattile, le antennule sono invece specializzate nella percezione olfattiva-gustativa.

Questi parametri sono stati scelti in quanto, oltre ad essere diagnostici di un’eventuale percezione sensoriale, sono quantificabili in modo oggettivo e consentono un’analisi di tipo statistico. Diversamente, le osservazioni più strettamente di tipo comportamentale come la descrizione posturale dell’animale, seppur interessanti, non consentono una elaborazione numerica del dato. In ogni caso, il comportamento individuale è stato osservato annotando, in particolare, la postura degli animali ed eventuali movimenti stereotipati.

Successivamente è stata calcolata la differenza tra la durata dei parametri (1) e (2) in fase sperimentale e in fase di controllo ed il dato netto ottenuto è stato analizzato con appropriati test statistici. In questo modo è stato anche possibile distinguere tra individui reattivi (R, ovvero individui che mostrano un cambiamento nel tempo speso nelle attività di locomozione

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o movimento antennale tra la fase di controllo e la fase di trattamento) o non-reattivi (NR, ovvero individui che spendono lo stesso tempo con uno scarto di ±15 sec nelle due fasi). I gamberi sperimentali erano osservati ogni giorno una sola volta in un ordine completamente randomizzato e tale che ogni giorno erano somministrati tutti i pool fagici e il controllo (in questo modo abbiamo evitato che le possibili alterazioni nella risposta legate alla permanenza in laboratorio influenzassero il risultato) ma ogni test era effettuato sempre su gamberi sperimentali diversi (per evitare una pseudo-replicazione delle osservazioni), ottenendo 25 repliche per pool in 25 giorni di esperimenti. Al termine delle osservazioni comportamentali, le vasche erano svuotate e accuratamente lavate prima di essere nuovamente riempite di acqua. Gli animali erano alimentati ogni tre giorni, sospendendo le osservazioni. I test sono stati condotti presso i laboratori di Biologia dell’Università di Firenze tra le 9 e le 13 dal 27 di maggio al 4 luglio 2014.