Espressione del VEGF e dei suoi recettori

Come mostrato in figura 10A, la lunghezza prevista per ciascun prodotto di PCR è stata confermata dall’elettroforesi in gel di agarosio degli ampliconi ottenuti amplificando il cDNA ottenuto da retine normossiche (215, 125, 239 e 182 pb corrispondenti rispettivamente all’mRNA di VEGF, VEGFR-1, VEGFR-2 e Rpl13a). In accordo con precedenti risultati ottenuti dal nostro gruppo di ricerca (Dal Monte et al., 2009; Dal Monte et al., 2007), nelle retine ipossiche risulta un incremento significativo dei livelli di mRNA di VEGF, VEGFR-1 e VEGFR-2 (inserto in Fig. 10B-D) rispetto alle retine normossiche. Come riportato in figura 10B, i livelli di VEGF mRNA sono risultati significativamente ridotti dal trattamento con propranololo sia somministrato alla dose di 2 mg kg-1 che di 20 mg kg-1 ( 30% e 60%, P < 0,05 e P < 0,001, rispettivamente). In particolare, la riduzione di VEGF mRNA dopo trattamento con propranololo a 20 mg kg-1 è risultata significativamente maggiore rispetto a quella ottenuta con propranololo a 2 mg kg-1 ( 50%, P < 0,01). Invece, dosi di 0,02 mg kg-1 non hanno influenzato i livelli di VEGF messaggero. Come mostrato nelle figure 10C-D, il trattamento con propranololo 20 mg kg-1 non ha determinato alterazioni nei i livelli ipossici di mRNA dei recettori del VEGF.

Figura 10. Livelli dei messaggeri di VEGF, VEGFR-1 e VEGFR-2 nelle retine di topo. (A) Prodotti di PCR di VEGF (105pb),

VEGFR-1 (116 pb), VEGFR-2 (114 pb) e dell’housekeeping Rpl13a (182 pb) in retine normossiche. (B) L’analisi con PCR real- time mostra che il trattamento con propranololo determina una diminuzione dei livelli di VEGF mRNA in modo dose-dipendente nelle retine ipossiche (*P < 0,05 e P < 0,001 versus topi trattati con veicolo; §P < 0,01 versus topi trattati con propranololo a 2 mg kg-1; ANOVA). Nell’inserto, sono mostrati i livelli del messaggero di VEGF in condizioni di normossia (bianco) e ipossia (nero). L’analisi con PCR mostra che il trattamento con propranololo non influenza i livelli dei messaggeri sia di VEGFR-1 (C) che di VEGFR-2 (D). Nell’inserto, sono mostrati i livelli dei messaggeri di VEGFR-1 e VEGFR-2 in condizioni di normossia (bianco) e ipossia (nero). I dati sono stati analizzati mediante la formula del 2-ΔΔCT usando Rpl13a come gene di controllo. Ogni colonna rappresenta la media ± SE dei dati ottenuti da 4 campioni. Ciascun campione si riferisce all’mRNA estratto da 2 retine.

È stata inoltre misurata la quantità di VEGF proteina nella retina utilizzando la tecnica ELISA. Nelle retine ipossiche è stato evidenziato un aumento significativo dei livelli di VEGF (inserto in Fig. 11). I livelli di VEGF, sia nella retina normossica che ipossica sono in linea con quelli misurati in precedenti studi sulla retina di roditori (Dal Monte et al., 2009). Come mostrato in figura 11 è stata osservata una diminuzione dose-dipendente di VEGF proteina dopo trattamento con dosi crescenti di propranololo. In particolare, non è stato osservato alcun effetto dopo trattamento con propranololo a 0,02 mg kg-1, mentre è stata evidenziata una diminuzione dei livelli di VEGF dopo somministrazione di propranololo a 2 mg kg-1 ( 65% versus trattamento con veicolo, P < 0,001) che si è evidenziata più accentuata dopo trattamento con il farmaco a 20 mg kg-1 ( 85% versus trattamento con veicolo, P < 0,001 e 60% versus trattamento con propranololo a 2 mg kg-1, P < 0,001).

Figura 11. Livelli di VEGF proteina in retine di topo quantificati mediante tecnica ELISA. La somministrazione del veicolo non

influenza i livelli di VEGF, mentre si osserva una diminuzione dose-dipendente di VEGF in seguito a trattamento con dosi crescenti di propranololo con nessun effetto a 0,02 mg kg-1, una riduzione a 2 mg kg-1 (*P < 0,001 versus topi trattati con veicolo; ANOVA) e una maggiore riduzione a 20 mg kg-1 (*P < 0,001 versus topi trattati con veicolo e §P < 0,001 versus topi trattati con propranololo a 2 mg kg-1; ANOVA). Nell’inserto sono mostrati i livelli di VEGF in condizione di normossia (bianco) e ipossia (nero). Ogni colonna rappresenta la media ± SE dei dati provenienti da 5 campioni. Ciascun campione si riferisce alle protein e estratte da 2 retine.

Al fine di valutare se il trattamento con propranololo 20 mg kg-1 fosse in grado di influenzare i livelli di VEGF in condizioni di normossia abbiamo eseguito esperimenti di PCR real-time e di ELISA su retine di topi mantenuti in condizioni normossiche e trattati con propranololo da PD12 a PD16. I risultati ottenuti mostrano che nella retina normossica, né i livelli di VEGF mRNA né il contenuto di VEGF proteina vengono influenzati dal propranololo a 20 mg kg-1 (Fig. 12A-B).

Figura 12. Livelli di VEGF mRNA e proteina in retine normossiche dopo trattamento con propranololo. Né il livello di

messaggero del VEGF nè il contenuto di VEGF proteina in retine normossiche sono influenzati dal propranololo a 20 mg kg-1. Negli esperimenti di PCR, dati sono stati analizzati mediante la formula del 2-ΔΔCT usando Rpl13a come gene di controllo. Ogni colonna rappresenta la media ± SE dei dati ottenuti da 4 campioni. Ciascun campione si riferisce all’mRNA estratto da 2 retin e. Negli esperimenti di ELISA, ogni colonna rappresenta la media ± SE dei dati provenienti da 5 campioni. Ciascun campione si riferisce alle proteine estratte da 2 retine.

Al fine di determinare se il fattore di trascrizione HIF-1α potesse essere coinvolto nel processo d’inibizione dell’espressione del VEGF indotto dal trattamento con propranololo, abbiamo valutato se il blocco dei beta-ARs potesse essere correlato alla variazione dei livelli retinici di HIF-1α nel modello OIR. Come mostrato in figura 13, l’espressione retinica di HIF-1α è risultata aumentata in topi OIR ( 7,5 volte) rispetto alla nidiata di controllo mantenuta in normossia (P < 0,001). La somministrazione del veicolo non ha alterato i livelli ipossici di HIF-1α, mentre il trattamento con propranololo 20 mg kg-1 ha indotto un parziale ripristino dell’espressione di HIF- 1α. Infatti, anche se i livelli di HIF-1α restano maggiori in confronto a quelli valutati in condizioni normossiche (P < 0,01), il trattamento con il farmaco determina una riduzione di circa il 50% rispetto ai livelli misurati nelle retine di topi ipossici trattati con veicolo (P < 0,001).

Figura 13. Livelli di HIF-1α in condizioni di normossia (bianco) e ipossia (nero) valutati mediante Western blot utilizzando la β-

actina come controllo interno. L’analisi densitometrica mostra un aumento significativo dei livelli di HIF-1α in conseguenza dell’ipossia (**P < <0,001 versus il rispettivo normossico; ANOVA). I livelli ipossici di HIF-1α non sono influenzati dal trattamento con veicolo, mentre sono ridotti dal propranololo a 20 mg kg-1 (§P < 0,01 versus topi trattati con veicolo; ANOVA). Il livello di HIF-1α dopo propranololo è comunque maggiore del rispettivo normossico (*P < 0,01; ANOVA). Ogni colonna rappresenta la media ± SE dei dati provenienti da 3 campioni. Ciascun campione si riferisce alle proteine estratte da 4 retine. N: normossia, H: ipossia, V:veicolo, P: propranololo.