Espressione delle sequenze studiate

Il ciclo vitale dei trasposoni a DNA consiste nella trascrizione e traduzione di geni, facenti parte del genoma del trasposone, codificanti enzimi specifici quali la trasposasi, che vengono utilizzati per la excisione e l’inserimento in altro locus del trasposone stesso. Il ciclo vitale dei trasposoni di classe I (fra i quali i LINEs) consiste invece nella trascrizione dell’elemento, che codifica diversi enzimi impegnati nella retrotrascrizione dell’RNA e nel successivo inserimento del cDNA in un locus supplementare. In entrambi i casi la trascrizione degli elementi è cruciale per la loro riproduzione.

Per verificare se i trasposoni cui putativamente appartengono le sequenze sottoposte al nostro studio sono attivi nella trascrizione, l’espressione delle tre sequenze è stata analizzata mediante RT-PCR. Nelle sequenze selezionate sono stati individuati dei domini conservati a livello nucleotidico, su cui sono stati progettati i primer (evidenziati nei multiallineamenti delle pagine precedenti). La RT-PCR è stata condotta in due organi molto diversi, cioè in foglie adulte (un tessuto somatico) e in embrioni a 28 giorni dalla impollinazione. Da questi due tessuti sono stati isolati e retrotrascritti gli RNA messaggeri, e i cDNA così ottenuti sono stati sottoposti a PCR utilizzando i primer specifici per ciascuna delle tre sequenze di girasole selezionate.

In una prima PCR che utilizzava come stampo il cDNA amplificato si osservavano bande molto leggere, non significative. I prodotti della prima amplificazione sono stati però utilizzati come stampo per una ulteriore PCR utilizzando primer nested appositamente progettati per le tre sequenze, impiegando le medesime condizioni di reazione. Nella figura 20 è riportato un gel di agarosio dopo elettroforesi dei campioni di cDNA sottoposti a PCR. Si può osservare che tutti e tre i trasposoni selezionati vengono amplificati (RT1, RT2 ed RT3), indicando che le relative sequenze genomiche sono attivamente trascritte.

RT1 C1 RT2 C2 RT3 C3

Fig. 20 - Prodotti di PCR su cDNA di foglie, utilizzando come stampo cDNA (RT) o RNA come controllo (C). RT1 contiene l’amplificato con primer corrispondenti al trasposone HAG003H10; RT2 l’amplificato con primer del trasposone HAG003I05; RT3 l’amplificato con primer del LINE HAG004M10. C1, C2 e C3 sono i controlli corrispondenti ai tre elementi. L’ultima lane a destra è il marcatore di peso molecolare (Marker X, Roche).

Al fine di escludere che l’amplificazione fosse dovuta non allo stampo di cDNA, ma ad eventuale DNA genomico contaminante l’RNA, la reazione di PCR è stata realizzata anche direttamente su RNA non retrotrascritto (C). Per quanto riguarda questi controlli, nei primi due casi (C1 e C2) non c’è traccia di frammenti amplificati; mentre nel terzo caso (C3), il LINE, la banda che compare nella lane di controllo ha un peso palesemente inferiore rispetto al prodotto di PCR retrotrascritto, per cui possiamo escludere che l’amplificato dopo retrotrascrizione sia dovuto a una contaminazione di DNA genomico.

In altri controlli sono state eseguite anche prove di PCR utilizzando primer singoli, senza osservare prodotti di amplificazione, sia in prima che in seconda PCR. Si può escludere quindi che le bande osservate siano risultato di amplificazione aspecifica.

In effetti, il prodotto di PCR ottenuto nel caso del trasposone HAG003H10 (RT1) è risultato essere circa 290 pb (come atteso); nel caso del trasposone HAG003I05 (RT2) il prodotto di PCR ha una lunghezza di circa 190 pb. (come atteso); nel terzo caso il prodotto corrispondente al LINE HAG004M10 (RT3) ha una lunghezza di circa 190 pb (come atteso).

Per quanto riguarda le prove effettuate su campioni di foglie ed embrioni non sono state riscontrate differenze nell’espressione degli elementi considerati; sia i trasposoni che il LINE sembrano essere espressi in modo costitutivo in entrambi gli stadi fenologici.

I risultati degli esperimenti di espressione confermano quanto si va affermando negli ultimi anni. In molti studi, infatti, viene evidenziato come una grande parte del genoma, oltre alle sequenze tipicamente codificanti geni ed RNA, venga trascritta, includendo sequenze ripetute apparentemente non codificanti (Wu et al., 2008). In girasole, recentemente, è stata dimostrata una elevata espressione di elementi retrotrasponibili con LTR, sia di tipo copia che di tipo gypsy (Vukich, Tesi di Dottorato di Ricerca, 2008). Questa elevata espressione non comporta alti tassi di inserimento di nuove copie di retroelementi nel genoma: un solo polimorfismo legato all’inserimento di un nuovo retrotrasposone è stato osservato in circa cento individui analizzati, a fronte dell’elevata trascrizione di questi elementi.

E’ quindi probabile che la trascrizione non sia seguita dalla successiva traduzione delle proteine corrispondenti, ma che l’RNA venga degradato, probabilmente attraverso processi analoghi all’interferenza dell’RNA (Baulcombe, 2004). La continua trascrizione di questi elementi (compresi i trasposoni da noi analizzati in questa Tesi di

Laurea) potrebbe avere anche il significato di produrre sequenze di RNA che possono essere utilizzate per la produzione di microRNA e per il conseguente silenziamento degli elementi stessi.

Se infatti il ciclo vitale dei vari tipi di trasposoni venisse portato a termine, l’effetto mutageno del continuo inserimento di nuovi elementi potrebbe essere estremamente deleterio per l’organismo, in quanto potrebbero essere interrotti geni codificanti.

CONCLUSIONI

Lo studio condotto in questa tesi di laurea ha permesso una prima caratterizzazione in girasole di sequenze non codificanti di origine virale che generalmente compaiono nel genoma delle piante in un basso numero di copie. In particolare, sono state studiate due sequenze con elevata similarità a porzioni codificanti di trasposoni a DNA, di classe II (HAG003H10 e HAG003I05).

Questa classe di trasposoni, che è stata scoperta per la prima volta in mais ed è responsabile di parte della variabilità genetica in questa specie, non era fino ad ora mai stata descritta in girasole.

Le analisi hanno mostrato che le due sequenze studiate sono trasposoni a DNA delle famiglie Mariner e hAT e che si presentano con frequenze abbastanza elevate rispetto a quanto osservato in altre specie. Infatti, questi elementi trasponibili si spostano nel genoma per mezzo di un meccanismo “taglia e incolla”, che non dovrebbe determinare un incremento del numero di copie. Soprattutto la HAG003H10 è presente in circa 700 copie per genoma aploide, non solo in girasole, ma in quasi tutte le specie di

Helianthus studiate. La ridondanza di queste sequenze è risultata molto simile all’interno

del genere Helianthus, indicando che i processi che hanno portato alla amplificazione di questa sequenza sono avvenuti in gran parte nel progenitore di questo genere.

Un numero di copie relativamente alto di trasposoni di classe II, come quelli studiati in questa Tesi di Laurea, può essere spiegato con numerose successive “infezioni” da parte di questi elementi o, più probabilmente, con l’inserimento di un trasposone (o pochi trasposoni) dentro un trasposone di classe I e con la successiva amplificazione di questo. L’osservazione che RNA complementari alle sequenze da noi studiate possono essere messi in evidenza mediante RT-PCR in embrioni e foglie di girasole indica che questi trasposoni sono potenzialmente attivi, cioè in grado di far produrre alla cellula gli enzimi, come la trasposasi, necessari per la loro trasposizione.

Per quanto riguarda la terza sequenza studiata (HAG004M10), essa ha mostrato una elevata similarità di sequenza con una superfamiglia di trasposoni di classe I, i LINE, retrotrasposoni senza lunghe ripetizioni terminali, che sembrano essere i più antichi elementi di origine retrovirale ad avere “invaso” il genoma degli eucarioti. Anche per questo tipo di sequenze, i nostri dati sono i primi ad essere disponibili in girasole.

Sebbene il meccanismo di riproduzione dei LINE sia di tipo “copia e incolla” e consenta quindi un progressivo incremento del numero di copie di questi elementi, i

LINE risultano molto frequenti soprattutto nell’uomo e negli altri animali, mentre sono molto meno ripetuti nelle piante. Vanno però considerati i recenti dati sul sequenziamento del genoma della vite, in cui i LINE appaiono molto ripetuti, suggerendo che non è possibile fare una generalizzazione a questo livello.

In girasole, i LINE sono risultati pochissimo ripetuti, e la sequenza da noi studiata, corrispondente alla porzione codificante la retrotrascrittasi, si presenta in circa 50 copie per genoma aploide sia in girasole che negli altri Helianthus. Tuttavia, anche questa sequenza è risultata espressa negli embrioni e nelle foglie, indicando che l’elemento cui la sequenza appartiene è potenzialmente attivo e quindi suscettibile di aumentare il proprio numero di copie. E’ importante osservare che in mais sono proprio i retrotrasposoni presenti in basso numero di copie ad essere attivi nella trascrizione (Meyers et al., 2001), probabilmente a causa del fatto che un retrotrasposone molto diffuso può essere più facilmente silenziato mediante produzione di micro RNA e successiva metilazione della cromatina contenente il DNA ad essi complementare, rispetto a un retrotrasposone più raro.

Il dato sull’espressione delle sequenze da noi studiate, trasposoni di classe II e LINE, che in linea teorica non avrebbero dovuto risultare trascritte, è interessante anche alla luce di recenti risultati, riguardanti per esempio il genoma umano, che mostrano che le sequenze espresse sono molte di più rispetto a quanto si ipotizzava sulla base del numero di geni codificanti proteine presenti nel genoma degli eucarioti (Wu et al., 2008). Il significato di questa espressione “generalizzata” non è chiaro, è stato ipotizzato che essa sia coinvolta nei processi di silenziamento, fornendo la “materia prima” per la produzione di microRNA, ma altre funzioni non possono essere escluse.

Riguardo al girasole, un’analisi di tipo trascrittomico, già iniziata presso il Dipartimento di Biologia delle Piante Agrarie, dovrebbe consentire di chiarire se la trascrizione, osservata per queste sequenze e anche per sequenze di retrotrasposoni di tipo Gypsy e Copia (Vukich, Tesi di Dottorato di Ricerca, 2008) sia osservabile o meno per tutta la componente ripetitiva (tipicamente “non codificante”) del genoma.

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