La sensività percettiva delle cellule chemosensoriali è molto influenzata dalla possibilità di riuscire captare i composti sia da un punto di vista fisico, che chimico mediante la loro degradazione. Una funzione particolarmente importante è data da delle ghiandole salivari minori situate al di sotto della papilla circumvallata dette di von Ebner.
Si tratta principalmente di una ghiandola sierosa sotto il controllo del nervo simpatico e parasimpatico. Dal punto di vista sensoriale la sua funzione è importante perché secerne enzimi che frammentando le molecole rendono accessibili i siti chimici riconosciuti dai recettori. Per questo suo ruolo è stato proposto (Sbarbati et al. 1999) che assieme alla papilla circumvallata costituisca un’unità funzionale del meccanismo di gusto periferico.
Per esempio le lipasi linguali che sono secrete dalle ghiandole di von Ebner oltre a iniziare la digestione dei trigliceridi introdotti con la dieta (le lipasi linguali sono acido resistenti e la loro
Figura 4.1.1. Indagini di RT-PCR sull’espressione di CFTR, CC26 e CC10.
L’analisi tramite PCR rileva la presenza dei trascritti dei tre geni all’interno della papilla circumvallata e delle ghiandole sierose, come nella trachea e nei bronchioli dove
risultavano ben espressi. Non viene rilevata alcuna presenza nella ghiandola mucosa e nell’esofago (controllo negativo). Il gene costitutivo GAPDH è stato utilizzato come normalizzatore e controllo. Mar ker Circ umv Pap Bro nchi oles Trac hea Oes opha gus Muc ous Gla nds Sero usG land s GAPDH 273 bp CFTR 403 bp CC26 477 bp CC10 70 bp
attività prosegue anche nello stomaco) rendono disponibili gli acidi grassi liberi rendendo possibile percepire il livello di grasso contenuto in un cibo.
Questo oltre ad aumentare l’appetibilità degli alimenti grassi, permette di attivare le secrezioni biliari per preparare l’intestino all’arrivo del cibo e di percepire prima dell’arrivo di stimoli post- assorbitivi la quantità di cibo ingerito (Laugerette et al., 2005).
Il coinvolgimento delle ghiandole di von Ebner in un questo tipo di secrezione permette la diffusione dell’amilasi direttamente nel solco che circonda la papilla circumvallata (Azzali et al. 1989; Riva et al. 1999) approvvigionando il micro ambiente (Mese and Matsuo 2007) in cui sono esposti i recettori dei calici gustativi. Ciò permette la rilevazione da parte dei recettori dedicati al sensing del dolce di polisaccaridi e di oligosaccaridi (Tremblay and Charest 1968; Field et al. 1989), che altrimenti non verrebbe percepito come fonte zuccherina.
I roditori hanno una grande capacità di riconoscere cibi ricchi in amido e di distinguerne le diverse concentrazioni che però non è collegata alla secrezione di amilasi salivare (Ramirez 1991). Quindi i roditori possiedono un meccanismo di chemocezione dei polisaccaridi che non richiede l’amilasi. È stato proposto che abbiano un recettore specifico per i polisaccaridi non ancora caratterizzato che utilizza gli stessi meccanismi di traduzione del segnale del dolce (α-gustducin e TRPM5) (Sclafani et al. 2007), ma non il recettore (T1R3) (Zukerman et al., 2009).
La recente scoperta che gli enterociti dell’epitelio duodenale sono in grado di esprimere le amilasi luminali pancreatiche ha suggerito che allo stesso modo le TCRs potessero esprimere l’amilasi espressa nella cavità orale.
Il lume duodenale ha un’associazione anatomica con le cellule esocrine del pancreas attraverso i dotti pancreatici che drenano l’amilasi pancreatica sulla superficie dell’epitelio duodenale. Questa organizzazione strutturale ricorda quella della papilla circumvallata e delle sottostanti ghiandole di von Ebner. Il nostro gruppo ha sondato la possibilità che come per gli enterociti anche TCRs possano esprimere amilasi tramite immunocitochimica ( Merigo et al., 2008, “ Amylase expression in taste receptor cells of rat circumvallate papillae”). Poiché stata trovata una marcatura positiva la presenza della proteina e la specificità della marcatura è stata confermata tramite western blot (figura 4.1.2). Come organo di controllo positivo ho utilizzato campioni tessutali di pancreas, come controllo negativo il rene. La banda che dà immunoreattività è di circa 53 kDa, ossia il peso atteso in kDa dell’amilasi, confermando la specificità dell’anticorpo. Come standard interno è stata usata la beta actina. Il raffronto delle immunoreattività verso la beta actina indica che nei taste buds l’amilasi è come atteso molto meno espressa rispetto alle ghiandole di von Ebner. Come ulteriore controllo la membrana è stata ibridata anche con l’anticorpo primario bloccato con il peptide di bloccaggio, che non dà alcun segnale. Un’ulteriore verifica della presenza dell’amilasi è stata
effettuata sugli stessi tessuti amplificando l’RNA messaggero mediante reazione di RT-PCR (figura 2D).
In seguito a queste verifiche lo studio è proseguito ricercando le colocalizzazione nei TCRs con altri marcatori immunocitologici: protein gene product 9.5 (PGP 9.5) e chromogranin A (CgA) per le cellule endocrine, α-gustducin and phospholipase e PLCβ2 come marcatori delle cellule di tipo II, CFTR e CC10 come marcatori di secrezione.
L’utilizzo di tecniche di immunoistochimica ha permesso di evidenziare per la prima volta la presenza di amilasi all’interno dei calici gustativi e la loro colocalizzazione con proteine coinvolte nella traduzione del segnale gustativo (α-gustducin, PLCβ2) e la secrezione (CC10 e CFTR). L’immunoreattività dell’amilasi nella zona apicale delle TCRs e la conferma della trascrizione genica di questo enzima suggerisce che le TCRs producano e secernano amilasi prendendo anche essi parte alla digestione dei carboidrati. Inoltre la colocalizzazione con cellule capaci di trasdurre il segnale chemosensoriale suggerisce che tale produzione possa essere regolata, e conferma il concetto che all’interno dei taste buds agiscano diversi pathways.
Figura 4.1.2. Indagini di RT-PCR sull’espressione di CFTR, CC26 e CC10. L’analisi tramite PCR rileva
la presenza dei trascritti dei tre geni all’interno della papilla circumvallata e delle ghiandole sierose, come nella trachea e nei bronchioli dove risultavano ben espressi. Non viene rilevata alcuna presenza nella ghiandola mucosa e nell’esofago (controllo negativo). Il gene costitutivo GAPDH è stato utilizzato come normalizzatore e controllo.