ESPRESSIONE DI PIMT, GERMINABILITÀ E VIGORE

La Tabella 15 riporta le correlazioni tra variabili fisiologiche e livello di espressione genica entro i diversi trattamenti. Germinabilità e T50 sono risultati, come atteso, sempre inversamente correlati, benché abbiano raggiunto la soglia di significatività solamente in risposta al priming, sia da solo (r = -0,80; P 0,001) che applicato dopo aging (r = -0,51; P 0,05), evidenziando in questo modo la capacità del trattamento di influenzare positivamente la performance del seme in termini di germinazione. Passando ad esaminare le relazioni tra variabili fisiologiche e la quantità di trascritto di PIMT, nel seme quiescente e in quello invecchiato artificialmente non si sono rilevate correlazioni significative. D’altra parte il FC è risultato correlato negativamente con la germinabilità (r = -0,57; P 0,05) in seguito a solo priming e con la germinabilità e il T50 (rispettivamente r = -0,55 e r = 0,49; P 0,052) in seguito a priming dopo aging. Tali evidenze, che escluderebbero un atteso parallelismo tra l’abbondanza di trascritti e l’elevato vigore, potrebbero d’altra parte essere indicative di una risposta cellulare in termini di repair attiva nelle condizioni fisiologiche create dal priming. L’espressione di PIMT potrebbe cioè segnalare tali condizioni senza peraltro che la sua presenza abbia un immediato impatto positivo sulla germinabilità.

Si ritiene opportuno tuttavia segnalare una modesta correlazione (r = 0,47; P 0,068), ancorché non significativa, tra il livelli di espressione di PIMT nel seme secco e la germinabilità dopo aging. In tal caso l’elevato livello nel seme quiescente potrebbe indicare una buona condizione fisiologica del seme che lo renderebbe capace di tollerare più facilmente lo stress dell’invecchiamento. Allo stesso modo i valori di fold change dopo

invecchiamento accelerato correlano moderatamente (r = 0,52; P 0,05) con l’effetto dell’aging sulla germinazione finale. Sulla base di questi dati, tuttavia, non si può escludere che in girasole l’accumulo di trascritti di PIMT possa influire positivamente sulla capacità del seme di rimanere vitale in condizioni che favoriscono il deterioramento. Le condizioni di aging applicate in questo studio, forse eccessivamente blande, potrebbero non essere state adeguate per evidenziare eventuali differenze di risposta al trattamento. In Arabidopsis, utilizzando mutanti ottenuti per transgenesi, è stata documentata una stretta connessione tra l’accumulo della proteina PIMT1 nel seme maturo e il vigore e la vitalità del seme dopo trattamenti invecchiamento accelerato (Ogè et al., 2008).

Nella maggioranza degli studi condotti su PIMT, gli effetti negativi dell’aging sulla qualità fisiologica del seme sono stati correlati alla diminuzione dell’attività enzimatica (Ayyappan et al., 2006; Kester et al. 1997). I risultati qui riportati sono in generale accordo con quelli dei lavori condotti sulle altre specie nelle quali è stata studiata l’espressione del gene, i quali evidenziano che il seme secco costituisce il sito di massimo accumulo dei trascritti (Mudgett e Clarke, 1994; Verma et al., 2010). Questo aspetto è stato certamente confermato in questa indagine, che tuttavia ha rivelato l’esistenza di una notevole variabilità di espressione tra genotipi, non emersa precedentemente da altri studi di tipo fisiologico dove era analizzato un solo genotipo. Questa informazione potrà risultare utile nella scelta dei materiali per la conduzione di studi mirati a elucidare il ruolo di questo enzima nella qualità del seme.

La riduzione generalizzata, ed in alcuni casi drastica, del livello di espressione a seguito dell’aging, a cui tuttavia non ha corrisposto una analoga riduzione della qualità fisiologica, né in termini di correlazione, né in termini di valori medi di queste variabili (solo blanda per il T50, estremamente ridotta per la germinabilità), potrebbe essere considerata una conseguenza dell’imbibizione, più che un effetto deleterio del trattamento di invecchiamento artificiale. Anche questa osservazione sarebbe in linea con la riduzione del livello di espressione di PIMT a seguito di imbibizione riportata per le altre specie (Mudgett e Clarke, 1994).

La riduzione nell’efficienza dei meccanismi di riparazione degli acidi nucleici a seguito di invecchiamento accelerato è ampiamente documentata (Elder et al., 1987; Bray e West, 2005; Kranner et al., 2010a), mentre il ruolo svolto da quelli di riparazione proteica ha ricevuto meno attenzione. In girasole, in particolare, gli studi finora condotti si sono riferiti quasi esclusivamente agli effetti deleteri dell’aging sui sistemi di detossificazione dal danno ossidativo (Bailly et al 1996, 1998, 2002).

L’incremento della germinabilità finale e del tasso di germinazione, osservati dopo osmopriming da solo o dopo aging, hanno confermato l’efficacia dell’approccio per aumentare il vigore del seme. Gli effetti benefici del priming, documentati in molte specie, tra cui anche girasole (Chojnowski et al., 1997; Bailly et al., 2000), sono stati messi in relazione all’instaurarsi dei processi metabolici della germinazione, all’aumento dell’attività di vari sistemi antiossidanti e, in particolare quando è implicata la longevità del seme, all’attivazione di meccanismi di riparazione (Ashraf e Bray, 1993, Soeda et al., 2005). In questo lavoro, l’accumulo dei trascritti di PIMT nei

diversi trattamenti non suggerisce un coinvolgimento di questo meccanismo di riparazione nell’effetto invigorente osservato. D’altra parte, il pattern dell’espressione del gene sembra simile a quello verificato per altri trascritti o proteine con provata funzione protettiva (quali LEA, deidrine, CAT e SOD) che sarebbero più strettamente coinvolte nella protezione dal deterioramento durante la conservazione. Queste, accumulate essenzialmente durante la fase di disseccamento, vengono degradate quando il seme è parzialmente idratato durante l’osmopriming o nelle prime fasi della germinazione (Capron et al., 2000; Chen e Arora, 2011). Inoltre, A supporto di questa tesi, è rilevante che questo meccanismo di riparazione proteicasia particolarmente vantaggioso in condizioni di bassa o nulla attività metabolica, come quelle del seme quiescente, in cui non è possibile rimpiazzare le proteine danneggiate mediante sintesi de novo in relazione alle limitate disponibilità energetiche.

I) Isolamento e caratterizzazione della sequenza genomica di PIMT