Espressione dei geni codificanti gli enzimi detossificanti eme ossigenasi-1 (HO-1) e NAD(P)H: chinone ossidoreduttasi-1 (DT-

7.2 Modello sperimentale

8.2 Espressione dei geni codificanti gli enzimi detossificanti eme ossigenasi-1 (HO-1) e NAD(P)H: chinone ossidoreduttasi-1 (DT-

diaforasi) (NQO1)

Al fine di chiarire gli effetti a livello trascrizionale sugli enzimi HO-1 e NQO1 indotti dal trattamento con i glucosinolati presi in esame, sono stati effettuati esperimenti di RT-PCR.

In figura 25 sono riportati i risultati ottenuti in seguito al trattamento con glucoiberina, 20µM e 40µM a 4 ore di trattamento.

Per l’espressione dell’enzima DT-diaforasi si ha un incremento dell’intensità del segnale dopo il trattamento. Non trattandosi di PCR quantitativa non possiamo dare un valore esatto di induzione.

Per quanto riguarda l’espressione dell’enzima eme-ossigenasi non si registrano variazioni dell’espressione genica.

Fig.25: RT-PCR di HO-1 e NQO1 in epatociti di ratto di controllo (CTR) e trattati con GIB ( 20µM e

40µM per 4-24-48 ore). In basso è riportata la PCR per il gene housekeeping β-actina.

Il trattamento con SIN a 4 ore ha provocato un aumento dose dipendente a livello trascrizionale di entrambe i geni presi in esame (Fig.26).

Fig.26: RT-PCR di HO-1 e NQO1 in epatociti di ratto di controllo (CTR) e trattati con SIN ( 20µM e

40µM per 4 ore). In basso è riportata la PCR per il gene housekeeping β-actina.

Dopo 4 ore dal trattamento con GST si riscontra un’induzione dell’espressione dei geni DT-diaforasi ed eme-ossigenasi in maniera dipendente dalla concentrazione del glucosinolato usato per il trattamento (Fig.27).

Fig.27: RT-PCR di HO-1 e NQO1 in epatociti di ratto di controllo (CTR) e trattati con GST ( 20µM e

70 In figura 28 sono riportati i risultati ottenuti in seguito al trattamento con glucotropeolina, 20µM e 40µM, a 4 ore di trattamento. Per l’espressione dell’enzima DT-diaforasi dopo 4 ore di trattamento si nota un’induzione solo alla concentrazione più alta. Per quanto riguarda l’espressione dell’enzima eme-ossigenasi a 4 ore abbiamo un aumento dell’espressione a 40µM.

Fig.28: RT-PCR di HO-1 e NQO1 in epatociti di ratto di controllo (CTR) e trattati con GTL ( 20µM e

40µM per 4 ore). In basso è riportata la PCR per il gene housekeeping β-actina.

8.3 Western Blotting

Espressione della proteina eme-ossigenasi-1

Nelle frazioni microsomiali di epatociti primari di ratto trattati con i glucosinolati a concentrazioni di 20µM e 40µM per 48 ore, è stata investigata l'espressione dell'eme- ossigenasi-1 anche a livello proteico, effettuando un esperimento di elettroforesi su gel di poliacrilammide e western blotting mediante anticorpi preparati con antigeni eterologhi e con sviluppo di chemioluminescenza.

In figura 29 è riportato un esperimento di blotting in cui sono stati utilizzati anticorpi policlonali anti-HO-1 di ratto per analizzare campioni di epatociti primari di ratto di controllo, trattati con GST 20µM e 40µM.

Fig. 29: Western blotting eseguito su microsomi di epatociti primari di ratto. Sono stati caricati

20µg/pozzetto. Sono stati utilizzati anticorpi primari anti-HO-1 di ratto ottenuti nel coniglio e anticorpi secondari che riconoscono le immunoglobuline del coniglio coniugati con la perossidasi. In basso è riportata l'analisi densitometrica delle bande.

Nei campioni trattati con SIN 20µM e 40µM si nota un aumento dell’intensità della banda rispetto al controllo.

Anche in seguito al trattamento con GIB è possibile vedere un aumento dell’intensità della banda rispetto al campione di controllo (Fig.30).

Fig. 30: Western blotting eseguito su microsomi di epatociti primari di ratto. Sono stati caricati

72 In figura 31 è riportato il blotting successivo al trattamento con GST. Si può notare un aumento dell’intensità della banda nei campioni trattati rispetto ai campioni di controllo.

Fig.31: Western blotting eseguito su microsomi di epatociti primari di ratto. Sono stati caricati

Anche in seguito al trattamento con GTL 20µM e 40µM si registra un aumento dell’intensità delle bande dei campioni trattati rispetto al controllo (Fig.32).

Fig.32: Western blotting eseguito su microsomi di epatociti primari di ratto. Sono stati caricati

73 Attivazione di Nrf2

L’attivazione e la conseguente traslocazione di Nrf2 al nucleo è stata dimostrata tramite esperimenti di immunoblotting in epatociti primari di ratto trattati con i diversi glucosinolati.

In figura 33 è riportato un esperimento di blotting in cui sono stati utilizzati anticorpi policlonali anti-Nrf2 di ratto per analizzare campioni di epatociti primari di ratto di controllo e trattati con GST. Nel campione trattato con GST 20µM si nota un aumento dell’intensità della banda rispetto al campione di controllo. Per il trattamento alla concentrazione maggiore il segnale è di nuovo più alto rispetto al controllo, anche se di intensità minore rispetto al trattamento con GST 20µM. questi risultati sono segno dell’avvenuta attivazione di Nrf2 in seguito al trattamento con il glucosinolato.

Fig.33: Western blotting eseguito su estratto nucleare e citosolico di epatociti primari di ratto. Sono stati

caricati 60µg. Sono stati utilizzati anticorpi primari anti-Nrf2 di ratto ottenuti nel coniglio e anticorpi secondari che riconoscono le immunoglobuline del coniglio coniugati con la perossidasi. In basso è riportata l'analisi densitometrica delle bande.

74 In figura 34 è riportato l’esperimento di immunoblotting effettuato dopo trattamento degli epatociti con GTL e SIN. Dall’analisi densitometrica possiamo notare che le bande ottenute dall’estratto nucleare delle cellule trattate con SIN e GTL hanno un’intensità maggiore rispetto ai campioni di controllo. Nel citosol possiamo comunque notare la presenza della proteina d’interesse.

Fig.34: Western blotting eseguito su estratto nucleare e citosolico di epatociti primari di ratto. Sono stati

In seguito al trattamento con GIB possiamo osservare che, nell’estratto nucleare ottenuto dagli epatociti, si ha un aumento dell’intensità delle bande rispetto al campione di controllo. Inoltre, dall’analisi densitometrica, si nota la presenza di Nrf2 ance nella frazione citosolica (Fig.35).

Fig.35: Western blotting eseguito su estratto nucleare e citosolico di epatociti primari di ratto. Sono stati

Capitolo 9

Discussione

L’esposizione di animali e delle loro cellule a sostanze chimiche elettrofile provoca una serie di risposte biologiche dirette legandosi covalentemente agli acidi nucleici, alle proteine e a piccole molecole, e indirette provocando la diminuzione dei pool cellulari di sostanze riducenti. Tutti gli organismi eucarioti sono equipaggiati con sistemi protettivi per far fronte agli effetti dannosi di molecole ossidanti ed elettrofile, entrambe responsabili della patogenesi di malattie croniche, incluso il cancro, l’aterosclerosi, neurodegenerazione, e l’invecchiamento (Holtzclaw et al., 2004). Il pathway di Keap1- Nrf2-ARE gioca un ruolo fondamentale nella protezione delle cellule da stress sia esogeni che endogeni, ed è stato dimostrato che è implicato nella protezione dallo stress ossidativo, da danni a fegato e polmone (Enomoto et al., 2001). Nrf2, infatti, regola l’espressione di numerosi geni che codificano per enzimi coinvolti nella detossificazione delle specie reattive. Due delle categorie di geni modulati da Nrf2 sono i geni coinvolti nel metabolismo degli xenobiotici e antiossidanti.

Questo lavoro di tesi è stato concentrato sullo studio di sostanze di origine vegetale, in grado di indurre l’espressione di enzimi antiossidanti tramite l’attivazione del recettore Nrf2, e del metabolismo degli xenobiotici. Tali sostanze, particolarmente abbondanti nei cavoli, sono gli ITCs ed i precursori ad essi associati, i GLs. Sono stati scelti quattro glucosinolati con struttura chimica differente in modo tale da evidenziare un’eventuale differenza di comportamento: sinigrina (SIN), glucoiberina (GIB), gluconasturtina (GST) e glucotropeolina (GTL).

In seguito al trattamento degli epatociti con i quattro glucosinolati idrolizzati, presi in esame a diverse concentrazioni (20µM e 40 µM) e a tempi diversi (1 ora, 4 ore, 48 ore), abbiamo osservato un’induzione dose dipendente dell’attività enzimatica glutatione-S- transferasi, capace di catalizzare la coniugazione di sostanze chimiche elettrofile con il gruppo sulfidrilico del GSH, in seguito ai trattamenti con GIB, SIN e GTL.

Per quanto riguarda gli enzimi ad azione antiossidante come l’enzima catalasi, che svolge la funzione di catalizzare la decomposizione del perossido di idrogeno in ossigeno molecolare ed acqua senza la produzione di radicali liberi, abbiamo ottenuto un’induzione dose dipendente di tale attività solo in seguito al trattamento con GIB. L’enzima catalasi non è regolato dal meccanismo di attivazione molecolare mediato da

77 Nrf2. Per la glutatione reduttasi, capace di ridurre la forma ossidata del glutatione, l’induzione è stata osservata sia in seguito al trattamento con GIB sia con SIN.

È stato analizzato anche l’enzima di fase 1 DT-diaforasi che ha mostrato anch’esso un’induzione significativa della sua attività in seguito a tutti e quattro i trattamenti, dando quindi conferma di una possibile attivazione del fattore di trascrizione Nrf2. L’enzima di fase 1 etossicumarina-O-deetilasi ha dato risultati significativi solo dopo il trattamento con SIN. Si osserva infatti un’inibizione dose dipendente della suddetta attività.

Per quanto riguarda l’attività detossificante eme-ossigenasi 1 in seguito a trattamento con SIN e GST si è notata un’induzione dose dipendente della suddetta attività.

Gli esperimenti di Western Blotting effettuati con anticorpi policlonali anti-HO 1 di ratto, su microsomi di epatociti trattati con i glucosinolati idrolizzati a concentrazioni di 20µM, 40µM per 48 ore hanno confermato anche a livello proteico l’induzione osservata con i saggi enzimatici precedentemente suddetti, come effetto del trattamento con glucosinolati.

Sono stati eseguiti anche esperimenti di immunoblotting con anticorpi policlonali anti- Nrf2 di ratto riuscendo ad ottenere un segnale per tutti e quattro i trattamenti effettuati. Ciò dimostra la traslocazione di Nrf2 al nucleo e la sua attivazione.

Esperimenti di RT-PCR effettuati sugli stessi campioni hanno mostrato un aumento dell'espressione dei geni codificanti per NQO1 ed HO-1, quindi possiamo confermare che i glucosinolati presi in esame stimolano l’espressione di tali geni attraverso l’attivazione del meccanismo molecolare Nrf2-ARE, già visto per il sulforafano (Dinkova-Kostova et al., 2002).

In base ai risultati da noi ottenuti non abbiamo riscontrato differenze nell’azione dei vari isotiocianati, quindi non sembra che ci sia una correlazione tra la loro struttura chimica e la loro funzione. Possiamo concludere che gli isotiocianati attraverso l’attivazione dei geni antiossidanti e detossificanti, direttamente regolati dal fattore di trascrizione nucleare Nrf2, possano essere uno strumento per ridurre lo stress ossidativo e quindi prevenire gli effetti dannosi che esso provoca a livello dell’organismo.

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Nel documento Effetti di alcuni glucosinolati sul sistema antiossidante e sugli enzimi del metabolismo degli xenobiotici in colture di epatociti primari di ratto (pagine 76-94)