1- INTRODUZIONE
14.5 ESTRAZIONE DNA DA LATTE E PCR
E’ stato utilizzato un kit di estrazione di DNA disponibile in commercio ADIAPURE®, Adiagene and Company bioMérieux, Francia per estrarre il DNA da latte secondo le istruzioni del produttore. Per ogni campione di latte individuale e di massa sono stati analizzati 10 ml; il DNA estratto è stato immediatamente congelato a - 20 ° C. La PCR è stata effettuata su ciascun campione e con lo stesso protocollo descritto nel paragrafo precedente; 10 µl dell’amplificato sono stati analizzati mediante corsa mediante una corsa elettroforetica su gel di agarosio (1,5% p/v).
32
15 - RISULTATI
15.1 ESAME SIEROLOGICO ALLEVAMENTO A NUM.CAMPIONE RAZZA SESSO
DATA NASCITA ELISA SIERO S/P % ELISA Screening STATUS
1 F.I. F 05/07/2010 NEG 22,9% negativo 2 F.I. F 14/11/2010 NEG 24,42% negativo 3 F.I. F 26/04/2010 NEG 16,48% negativo 4 P.R. tipo S. F 08/01/2010 NEG 27,32% negativo 5 F.I. F 01/12/2007 NEG 8% negativo 6 F.I. F 02/08/2001 NEG 26,25% negativo 7 MTC F 25/10/2008 NEG 7,32% negativo 8 Altre razze F 18/07/2004 NEG 9,92% negativo 9 MTC F 10/08/2006 NEG 2,74% negativo 10 Altre razze F 05/05/2004 NEG 4,12% negativo 11 F.I. F 16/04/2010 NEG 19,38% negativo 12 B.A. F 03/09/2006 NEG 0,45% negativo 13 F.I. F 01/06/2002 NEG 7,63% negativo 14 F.I. F 01/04/2010 NEG 18,93% negativo 15 F.I. F 01/08/2010 NEG 4,73% negativo 16 F.I. F 01/07/2010 NEG 27,63% negativo 17 P.R. tipo S. F 02/10/2008 NEG 10,38% negativo 18 F.I. F 30/11/2006 NEG 5,64% negativo 19 F.I. F 14/12/2007 NEG 5,49% negativo 20 MTC F 02/07/2010 NEG 1,98% negativo 21 F.I. F 06/09/2010 NEG 4,27% negativo 22 PIEMONTESE M 01/06/2008 NEG 9,46% negativo
Tabella 7. Risultati dell’esame sierologico dei campioni dell’allevamento A
ALLEVAMENTO B
NUM.
CAMPIONE RAZZA SESSO
DATA NASCITA ELISA SIERO S/P % ELISA Screening STATUS
1 P.R. tipo S. F 02/02/2008 NEG 6,71% negativo 2 MTC F 10/11/2010 NEG 16,42% negativo 3 P.R. tipo S F 08/12/2007 NEG 41,37% negativo 4 B.A. F 06/12/2006 NEG 105,3% POSITIVO 5 B.A. F 17/08/2011 NEG 27,42% negativo 6 B.A. F 13/07/2006 NEG 17,06% negativo 7 B.A F 11/11/2010 NEG 11,70% negativo
33
ALLEVAMENTO C
NUM.
CAMPIONE RAZZA SESSO
DATA NASCITA ELISA SIERO S/P % ELISA Screening STATUS
1 F.I. F 23/12/2006 NEG 7,77% negativo 2 F.I F 12/02/2007 NEG 2,1% negativo 3 F.I F 05/05/2007 NEG 0% negativo 4 F.I F 25/02/2009 NEG 4,93% negativo 5 F.I F 25/10/2008 NEG 8,15% negativo 6 F.I F 06/11/2006 NEG 10,29% negativo 7 F.I F 11/11/2008 NEG 5,24% negativo 8 F.I F 08/06/2008 NEG 13,97% negativo 9 F.I F 13/01/2010 NEG 2,1% negativo 10 F.I F 25/09/2008 NEG 4,09% negativo 11 F.I F 25/08/2009 NEG 3,02% negativo 12 F.I F 01/10/2008 NEG 18,49% negativo 13 F.I F 06/10/2008 NEG 5,98% negativo 14 F.I F 12/10/2008 NEG 9,6% negativo 15 F.I F 06/11/2008 NEG 4,17% negativo 16 F.I F 07/12/2009 NEG 0,95% negativo 17 F.I. M 04/03/2011 NEG 0% negativo 18 F.I M 08/09/2011 NEG 2,18% negativo 19 F.I F 16/06/2009 NEG 1,87% negativo 20 F.I F 08/06/2009 NEG 0,26% negativo 21 F.I F 24/12/2007 NEG 2,25% negativo 22 F.I F 08/04/2009 NEG 9,6% negativo 23 F.I F 26/12/2008 NEG 6,31% negativo 24 F.I F 14/10/2007 NEG 16,5% negativo 25 F.I F 10/8/2010 NEG 4,4% negativo 26 F.I F 09/02/2010 NEG 1,18% negativo 27 F.I F 2406/2009 NEG 21,24% negativo 28 F.I F 17/12/2007 NEG 0,8% negativo 29 F.I F 27/05/2010 NEG 1,79% negativo 30 F.I F 03/03/2010 NEG 16,27% negativo 31 F.I F 16/11/2008 NEG 6,41% negativo 32 F.I F 08/03/2009 NEG 20,55% negativo 33 F.I F 21/03/2007 NEG 5,32% negativo 34 F.I F 10/01/2009 NEG 8,07% negativo 35 F.I F 23/06/2009 NEG 2,79% negativo 36 F.I F 26/05/2010 NEG 3,86% negativo 37 F.I F 21/03/2007 NEG 1,56% negativo 38 F.I F 08/07/2010 NEG 1,33% negativo 39 F.I F 16/04/2010 NEG 2,71% negativo 40 F.I F 07/03/2009 NEG 1,11% negativo
34
41 F.I F 31/07/2010 NEG 4,63% negativo 42 F.I F 21/04/2009 NEG 4,17% negativo 43 F.I F 15/11/2006 NEG 9,45% negativo 44 F.I F 16/03/2009 NEG 2,79% negativo 45 F.I F 24/0/2010 NEG 0% negativo 46 F.I F 25/02/2009 NEG 3,1% negativo 47 F.I F 05/03/2009 NEG 0% negativo 48 F.I F 20/06/2009 NEG 0% negativo 49 F.I F 03/12/2009 NEG 16,5% negativo 50 F.I F 26/03/2010 NEG 3,86% negativo 51 F.I F 22/06/2010 NEG 23,23% negativo 52 F.I F 03/10/2006 NEG 1,79% negativo 53 F.I F 31/03/2009 NEG 0% negativo 54 F.I F 23/03/2010 NEG 8,76% negativo 55 F.I F 16/01/2010 NEG 1,56% negativo 56 F.I F 15/09/2009 NEG 6,77% negativo 57 F.I F 11/05/2010 NEG 1,79% negativo 58 F.I F 26/06/2009 NEG 0% negativo 59 F.I F 20/12/2007 NEG 16,5% negativo 60 F.I F 12/03/2010 NEG 14,73% negativo 61 F.I F 04/09/2008 NEG 18,18% negativo 62 F.I F 05/03/2010 NEG 5,55% negativo 63 F.I F 29/08/2010 NEG 5,24% negativo 64 F.I F 29/07/2006 NEG 15,04% negativo 65 F.I F 27/05/2010 NEG 0% negativo 66 F.I M 01/03/2012 NEG 2,79% negativo
Tabella 9. Risultati dell’esame sierologico dei campioni dell’allevamento C
Tabella 10. % S/P e status del test ELISA di conferma del campione 4B positivo all’ELISA di screening
Una sola bovina dell’allevamento B è risultata positiva al test ELISA di screening; tale risultato non è stato confermato con il test ELISA di conferma (tabella 10).
Gli animali dell’allevamento A e C sono risultati tutti sieronegativi.
I valori % S/P e lo status di ciascun campione sono riportati rispettivamente nelle tabelle 7, 8 e 9 per gli allevamenti A, B e C.
Campione
% S/P
Status
35
15.2 ESAME COLTURALE, PCR DA DNA ESTRATTO DA COLONIE E DA LATTE
ALLEVAMENTO A Campione Latte individuale Coltura – Colorazione di Z-N Esito PCR HEYm+Mj HEYm M7H11
+ - inquinato + - inquinato + - inquinato
1A x x x NEG 2A x x x --- 3A x x x --- 4A x x x --- 5A x x x NEG 6A x x x --- 7A x x x NEG 8A x x x --- 9A x x x NEG 10A x x x NEG 11A x x x NEG 12A x x x NEG 13A x x x --- 14A x x x NEG 15A x x x --- 16A x x x NEG 17A x x x --- 18A x x x --- 19A x x x NEG 20A x x x NEG 21A x x x ---
36
ALLEVAMENTO B Campione Latte individuale Coltura – Colorazione di Z-N Esito PCR HEYm+Mj HEYm M7H11+ - inquinato + - inquinato + - inquinato
1B x x x NEG 2B x x x --- 3B x x x --- 4B x x x --- 5B x x x --- 6B x x x --- 7B x x x NEG Tabella 12. Risultati esame colturale, colorazione Ziehl – Neelsen e PCR allevamento B ALLEVAMENTO C Campione Latte individuale Coltura – Colorazione di Z-N Esito PCR HEYm+Mj HEYm M7H11 + - inquinato + - inquinato + - inquinato 1C x x x --- 2C x x x --- 3C x x x --- 4C x x x --- 5C x x x NEG 6C x x x --- 7C x x x --- 8C x x x --- 9C x x x NEG 10C x x x --- 11C x x x --- 12C x x x --- 13C x x x --- 14C x x x NEG 15C x x x --- 16C x x x --- 19C x x x --- 20C x x x --- 21C x x x --- 22C x x x ---
37
Campione Latte individuale Coltura – Colorazione di Z-N Esito PCR HEYm+Mj HEYm M7H11+ - inquinato + - inquinato + - inquinato
23C x x x --- 24C x x x --- 25C x x x NEG 26C x x x --- 27C x x x NEG 28C x x x --- 29C x x x --- 30C x x x --- 31C x x x --- 32C x x x NEG 33C x x x NEG 34C x x x --- 35C x x x --- 36C x x x NEG 37C x x x --- 38C x x x NEG 39C x x x --- 40C x x x NEG 41C x x x --- 42C x x x --- 43C x x x NEG 44C x x x --- 45C x x x --- 46C x x x NEG 47C x x x --- 48C x x x --- 49C x x x NEG 50C x x --- 51C x x --- 52C x x x NEG 53C x x x NEG 54C x x --- 55C x x --- 56C x x x NEG 57C x x x NEG 58C x x x NEG 59C x x ---
38
Tabella 13. Risultati esame colturale, colorazione Ziehl – Neelsen e PCR allevamento C
Campione Latte massale Coltura – Colorazione di Z-N Esito PCR HEYm+Mj HEYm M7H11
+ - inquinato + - inquinato + - inquinato
Allev. A Latte Crudo x x x NEG Allev. B Latte crudo x x x NEG Allev. C Latte crudo x x x NEG Allev. C Latte pastorizzato x x x ---
Tabella 14. Risultati esame colturale, colorazione Ziehl – Neelsen e PCR latte crudo massale allevamenti A, B,
C e latte massale pastorizzato allevamento C
Per quanto riguarda l’esame colturale 33 campioni di latte individuale ed i 3 campioni di latte massale crudo hanno permesso l’isolamento di microorganismi riconducibili a micobatteri in quanto positivi alla colorazione di Ziehl- Neelsen; il terreno da cui è stato possibile isolare il maggior numero di microorganismi è stato l’ HEYm + Mj, mentre gli altri due terreni sono risultati molto meno sensibili per l’isolamento.
È tuttavia da sottolineare come alcune colture su HEYm + Mj siano risultate inquinate (11/95) e quindi non valutabili.
Le PCR condotte sul DNA estratto dalle colonie hanno fornito esito negativo per Map. Stesso esito negativo si è avuto per tutte le PCR condotte su DNA estratto direttamente da latte.
Campione Latte individuale Coltura – Colorazione di Z-N Esito PCR HEYm+Mj HEYm M7H11
+ - inquinato + - inquinato + - inquinato
60C x x --- 61C x x --- 62C x x x NEG 63C x x x NEG 64C x x x NEG 65C x x x ---
39
16 - CONCLUSIONI
A fronte di una prevalenza variabile di Map negli allevamenti di bovine da latte in Italia e dell’approvazione da parte della Conferenza Stato Regioni, il 17 Ottobre 2013, delle “Linee guida per l’adozione dei Piani di controllo e per l’assegnazione della qualifica sanitaria degli allevamenti nei confronti della paratubercolosi bovina” si è ritenuto interessante valutare la situazione di alcuni allevamenti in provincia di La Spezia, che producono latte e lo destinano alla piccola e alla grande distribuzione. Questa indagine è stata suggerita dal fatto che entro un anno dall’approvazione delle linee guida il Servizio veterinario ASL competente per territorio assegnerà, sulla base delle informazioni sanitarie agli atti, la qualifica sanitaria per paratubercolosi ad ogni allevamento bovino. Per le metodiche di campionamento ed i test diagnostici da effettuare si sono seguite le indicazioni riportate nelle linee guida; nonostante la sierologia fosse fortemente suggestiva di negatività si è deciso di effettuare sia l' esame colturale sia la PCR sul DNA estratto da colonie potenzialmente riconducibili a micobatteri e sul DNA estratto dal latte individuale e di massa.
Dai risultati emersi dall’indagine possiamo concludere che Map non è presente negli allevamenti analizzati; tale condizione permette agli allevatori di intraprendere l’iter che porta alla certificazione d’allevamento secondo quanto esposto dalle linee guida in modo da acquisire un’ulteriore qualifica sanitaria e tutelare maggiormente la salute pubblica relativamente al latte da loro prodotto; queste ulteriori garanzie sanitarie consentono all’allevatore di disporre di nuove e concrete possibilità in termini di mercato nazionale ed internazionale sia per la vendita dei prodotti lattiero-caseari sia per la commercializzazione di animali.
40
17 - RINGRAZIAMENTI
Ringrazio il Prof. Domenico Cerri per la comprensione e la pazienza che cha ripetutamente dimostrato durante gli anni di corso.
Un sentito ringraziamento alla dott.ssa Alessia Galiero, per la competenza, la costante presenza, l’amicizia, il supporto scientifico e morale, e al dottor Filippo Fratini per i consigli, le capacità, la grande disponibilità e la simpatia.
Ringrazio tutto il personale della Struttura Complessa Sanità Animale dell’ ASL 5 Spezzino per avermi “ospitato” e fatta sentire parte integrante durante il lungo periodo di tirocinio; in particolare il Dott. Stefano Lodovichetti per la gentilezza, la capacità di sopportazione, il sostegno e per essere sempre stato presente, la Dott.ssa Elena Maria Teneggi per avermi dato la possibilità di partecipare attivamente ai progetti organizzati , il Dottor Angelo Bogazzi per l’aiuto nella mia crescita professionale, il Dott. Piero Gelli per la fiducia che ha riposto in me , la Dott.ssa Rita Ricca e il Dott. Giuseppe Adreani per la collaborazione nella non facile raccolta dei campioni, Manuela, Tatiana, Giorgio, Riccardo e Damiano per l’incoraggiamento e l’ affetto che mi dimostrano.
Ringrazio il Dott. Emilio Olzi per l’indiscutibile affabilità e per la sollecitudine con cui ha dispensato note utili alla stesura della tesi.
Ringrazio il Dott. Andrea Natali per l’appoggio incondizionato e per stimolarmi costantemente a migliorare sia professionalmente che come persona.
Ringrazio Serena, che è un’ amica sincera e premurosa, ed Elisabetta per aver reso più “leggeri” i periodi di tirocinio e i numerosi viaggi in macchina.
Un sincero grazie a tutti i miei compagni di specializzazione per aver stemperato i tre anni di corso con divertentissimi ricordi e tanti piacevoli momenti ricreativi .
41
18 - BIBLIOGRAFIA
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