EXPERIMENTAL DESIGN

Tossicità periferica indotta dalla somministrazione di epotilone B

Per ottenere un modello di neuropatia periferica indotto dalla somministrazione di epotilone B sono stati utilizzati 25 ratti Fischer femmine randomizzati in cinque gruppi da cinque animali ciascuno e trattati secondo tale schema:

Gruppo 1: animali di controllo non trattati

Gruppo 2: animali trattati con epotilone B ad una concentrazione di 0.25 mg/kg una volta a settimana per quattro settimane (EPO B 0.25 mg/kg 1qw x 4)

Gruppo 3: animali trattati con epotilone B ad una concentrazione di 0.5 mg/kg una volta a settimana per quattro settimane (EPO B 0.5 mg/kg 1qw x 4)

Gruppo 4: animali trattati con epotilone B ad una concentrazione di 1 mg/kg una volta a settimana per quattro settimane (EPO B 1 mg/kg 1qw x 4)

Gruppo 5: animali trattati con epotilone B ad una concentrazione di 1.5 mg/kg una volta a settimana per quattro settimane (EPO B 1.5 mg/kg 1qw x 4)

Metà degli animali di ciascun gruppo sono stati monitorati per altre 4 settimane (

follow-up

Sono stati valutati giornalmente la mortalità e lo stato di salute generale degli animali; il controllo del peso, invece, è stato effettuato due volte alla settimana. Alla fine del periodo di trattamento è stata valutata la velocità di conduzione dell’impulso nervoso lungo il nervo caudale e, successivamente, l'animale è stato sacrificato per inalazione di CO2. Da tre animali gruppo sono stati prelevati la cute per la determinazione della densità delle fibre intraepidermiche e i nervi ischiatici per la determinazione dell’espressione delle proteine mieliniche e l’analisi morfologica e morfometrica di una possibile neurotossicità indotta dai trattamenti.

Esperimento 1

Gruppi

Schedula di somministrazione settimanale

5 animali/gruppo Gruppo 1 Animali non trattati Gruppo 2 EPO B iv 0.25 mg/kg 1qw x 4 Gruppo 3 EPO B iv 0.5 mg/kg 1qw x 4 Gruppo 4 EPO B iv 1 mg/kg 1qw x 4 Gruppo 5 EPO B iv 1.5 mg/kg 1qw x 4

Ricerca della massima dose tollerata di sagopilone

Per mettere a punto un modello in grado di valutare quale sia la massima dose di sagopilone tollerata e ottenere un modello di neuropatia periferica sono stati utilizzati 30 ratti Wistar femmine randomizzati in sei gruppi da cinque animali ciascuno e trattati secondo tale schema:

Gruppo 1: animali di controllo non trattati Gruppo 2: animali trattati con il veicolo

Gruppo 3: animali trattati con sagopilone ad una concentrazione di 0.6 mg/kg una volta a settimana per quattro settimane (ZK-EPO 0.6 mg/kg 1qw x 4)

Gruppo 4: animali trattati con sagopilone ad una concentrazione di 1.2 mg/kg una volta a settimana per quattro settimane (ZK-EPO 1.2 mg/kg 1qw x 4)

Gruppo 5: animali trattati con sagopilone ad una concentrazione di 1.8 mg/kg una volta a settimana per quattro settimane (ZK-EPO 1.8 mg/kg 1qw x 4)

Gruppo 6: animali trattati con sagopilone ad una concentrazione di 2.4 mg/kg una volta a settimana per quattro settimane (ZK-EPO 2.4 mg/kg 1qw x 4)

Sono stati valutati giornalmente la mortalità e lo stato di salute generale degli animali; il controllo del peso, invece, è stato effettuato due volte alla settimana. Prima dell’inizio dei trattamenti, due settimane dopo l’inizio e alla fine del periodo di trattamento è stata valutata la velocità di conduzione dell’impulso nervoso lungo il nervo caudale e, successivamente, l'animale è stato sacrificato per inalazione di CO2. Da tre animali trattati con ZK-EPO 2.4 mg/kg e da tre animali appartenenti al gruppo controllo sono

stati prelevati i nervi ischiatici per effettuare l’analisi morfologica e valutare una possibile neurotossicità indotta dal trattamento.

Esperimento 2

Gruppi

Schedula di somministrazione settimanale

5 animali/gruppo Gruppo 1 Animali non trattati Gruppo 2 Animali trattati con il veicolo Gruppo 3 ZK-EPO iv 0.6 mg/kg 1qw x 4 Gruppo 4 ZK-EPO iv 1.2 mg/kg 1qw x 4 Gruppo 5 ZK-EPO iv 1.8 mg/kg 1qw x 4 Gruppo 6 ZK-EPO iv 2.4 mg/kg 1qw x 4

Ricerca della corretta scheda di somministrazione di sagopilone

Avendo stabilito, tramite il modello precedente, le dosi da utilizzare in grado di indurre la neuropatia periferica, per stabilire quale fosse il miglior metodo di infusione del sagopilone è stato messo a punto un altro modello in cui sono stati utilizzati 54 ratti Wistar femmine randomizzati in otto gruppi da sei animali ciascuno e trattati secondo tale schema:

Gruppo 1: animali di controllo non trattati Gruppo 2: animali trattati con il veicolo

Gruppo 3: animali trattati con sagopilone ad una concentrazione di 1.2 mg/kg somministrato in bolo una volta a settimana per quattro settimane (ZK-EPO 1.2 mg/kg 1qw x 4, bolo)

Gruppo 4: animali trattati con sagopilone ad una concentrazione di 1.2 mg/kg somministrato tramite un’infusione di 30 minuti una volta a settimana per quattro settimane (ZK-EPO 1.2 mg/kg 1qw x 4, inf 30’)

Gruppo 5: animali trattati con sagopilone ad una concentrazione di 1.2 mg/kg somministrato tramite un’infusione di 3 ore una volta a settimana per quattro settimane (ZK-EPO 1.2 mg/kg 1qw x 4, inf 3 ore)

Gruppo 6: animali trattati con sagopilone ad una concentrazione di 2.4 mg/kg somministrato in bolo una volta a settimana per quattro settimane (ZK-EPO 2.4 mg/kg 1qw x 4, bolo)

Gruppo 7: animali trattati con sagopilone ad una concentrazione di 2.4 mg/kg somministrato tramite un’infusione di 30 minuti una volta a settimana per quattro settimane (ZK-EPO 2.4 mg/kg 1qw x 4, inf 30’)

Gruppo 8: animali trattati con sagopilone ad una concentrazione di 2.4 mg/kg somministrato tramite un’infusione di 3 ore una volta a settimana per quattro settimane (ZK-EPO 2.4 mg/kg 1qw x 4, inf 3 ore)

Sono stati valutati giornalmente la mortalità e lo stato di salute generale degli animali; il controllo del peso, invece, è stato effettuato due volte alla settimana. Prima dell’inizio dei trattamenti, due settimane dopo l’inizio e alla fine del periodo di trattamento è stata valutata la velocità di conduzione dell’impulso nervoso lungo il nervo caudale e, successivamente, l'animale è stato sacrificato per inalazione di CO2. Da tre animali gruppo sono stati prelevati fegato e rene per effettuare analisi istopatologiche. Alla fine del periodo di trattamento sono stati effettuati prelievi di sangue per valutazioni ematologiche e ematochimiche di BUN, creatinina, AST e ALT; sono inoltre stati prelevati i nervi sciatici per effettuare analisi morfologiche e morfometriche e per valutare il grado di polimerizzazione della β-tubulina in seguito al trattamento con sagopilone.

Esperimento 3

Gruppi

Schedula di somministrazione settimanale

6 animali/gruppo Gruppo 1 Animali non trattati Gruppo 2 Animali trattati con il veicolo Gruppo 3 ZK-EPO iv 1.2 mg/kg 1qw x 4, bolo Gruppo 4 ZK-EPO iv 1.2 mg/kg 1qw x 4, inf 30’ Gruppo 5 ZK-EPO iv 1.2 mg/kg 1qw x 4, inf 3 ore Gruppo 6 ZK-EPO iv 2.4 mg/kg 1qw x 4, bolo Gruppo 7 ZK-EPO iv 2.4 mg/kg 1qw x 4, inf 30’ Gruppo 8 ZK-EPO iv 2.4 mg/kg 1qw x 4, inf 3 ore

3. VALUTAZIONE della TOSSICITA’ GENERALE e della