Sono stati utilizzati 24 ratti albini adattati alle normali condizioni di laboratorio (si veda la sezione Fase di messa a punto delle metodiche
sperimentali).
Condizioni sperimentali
Sono state selezionate in totale 7 condizioni sperimentali (Figura 10). Le prime tre corrispondevano a tempi diversi di esposizione alla Ta di -10°C ± 0,5 °C: rispettivamente 4 h 30' (E4), 24 h (E24) e 48 h (E48). I tempi di 24 e 48 h sono stati scelti sulla base di precedenti dati comportamentali e biochimici del nostro laboratorio (Zamboni et al., 2004); il punto a 4 h 30' è stato introdotto, come condizione acuta, già studiata in letteratura sul piano della c-Fos-ir (Cano et al., 2003), al fine di avere un test interno all'esperimento del funzionamento della reazione anticorpale e permetteva di valutare gli effetti sul sistema di un'esposizione di breve durata. Vi erano poi due condizioni di recupero alla normale Ta di laboratorio (23,5 ± 1.0 °C), entrambe della durata di 4 h 30', anch'esse scelte sulla base di precedenti dati comportamentali e biochimici (Zamboni et al., 2004): una successiva ad un periodo di esposizione di 24 h (E24R4), l'altra dopo un'esposizione di 48 h (E48R4). Infine, poiché il sacrificio
ed E48, sono state pensate due condizioni di controllo alla normale Ta di laboratorio, rispettivamente C4 e C24, al fine di corrispondere correttamente ai tempi dei trattati. Questa scelta derivava dall'esigenza di tener conto di eventuali fluttuazioni circadiane degli Ag studiati. Gli animali, divisi in quattro blocchi da 6 ratti, sono stati assegnati in maniera casuale ad ognuna delle condizioni sperimentali. In particolare, alle condizioni E4, E24R4 e E48R4 sono stati assegnati
4 casi, alle altre esposizioni e ai controlli 3 casi.
Poiché non era possibile fissare più di due animali al giorno, le perfusioni erano distribuite su un arco di 3 o 4 giorni e questo determinava una variabilità nell'adattamento da un minimo di 6 ad un massimo di 11 giorni. Data la durata variabile dei trattamenti (da 4 h 30' a 52 h 30'), l'ingresso in esperimento era regolato da un calendario che prendeva a riferimento il giorno in cui l'animale sarebbe stato perfuso. Alle h 09:00 dell'ultimo giorno di adattamento l'animale veniva pesato e alloggiato singolarmente in una nuova gabbia, quindi trasferito in una camera termoregolata, mantenuta alla temperatura di 23,5 ± 1,0 °C. Tutti gli animali venivano pesati anche immediatamente prima della fissazione tissutale (Tabella 4). Il trasferimento in camera fredda avveniva all'interno della stessa gabbia in cui l'animale era stato posto durante l'ultimo giorno di adattamento e non venivano operati ulteriori cambi di lettiera nel corso del protocollo sperimentale.
La camera fredda, immediatamente adiacente a quella termoneutrale, veniva portata a temperatura in maniera progressiva, iniziando con 2 o 3 giorni di anticipo, in modo da essere sicuri che la Ta si fosse stabilizzata, prima dell'inizio dell'esposizione. Era stata allestita una copertura con pannelli in polistirolo al fine di proteggere i ratti dalla ventilazione del sistema di raffreddamento, che avrebbe incrementato in maniera significativa la termodispersione, producendo una temperatura percepita sensibilmente inferiore a quella stabilita. Analogamente a quella della camera fredda, veniva controllata la stabilità della temperatura nella camera mantenuta a Ta normale. Tutti gli animali vi soggiornavano durante il giorno di adattamento precedente l'esposizione, durante il recupero per le condizioni che lo prevedevano e durante l'intero periodo nel caso dei controlli.
Acqua e cibo erano disponibili ad libitum per tutte le condizioni sperimentali, ma durante l'esposizione a bassa Ta, l'acqua tendeva a congelare, generando di fatto una deprivazione idrica (e conseguentemente anoressia), nonostante si avesse cura di cambiare i biberon due volte al giorno.
Processamento immunoistochimico
Al termine di ogni condizione sperimentale, l'animale veniva prelevato, pesato, sottoposto ad anestesia eterea e perfuso secondo le modalità già descritte. L'inizio della perfusione con paraformaldeide 4% corrispondeva alle h 09:33 o 14:03 ± 2 min. Sempre secondo le modalità precedentemente descritte, gli encefali, dopo l'estrazione, venivano sottoposti a post-fissazione per immersione nello stesso fissativo, crioprotetti e congelati in isopentano raffreddato con ghiaccio secco, separando prosencefalo e rombencefalo a livello mesencefalico.
Dal prosencefalo di ogni ratto sono state prodotte 81 consecutive sezioni coronali di 40 µm, numerate da 0 a 80, approssimativamente da bregma +0,70 mm a bregma -2,50 mm (Paxinos e Watson, 2005, Figura 11). La sezione più rostrale contenente la decussazione della ac (bregma -0,12 mm, Paxinos e Watson, 2005) corrispondeva al vetrino n. 20 o raramente 21. Ricordiamo che la numero zero e poi ogni quinta sezione venivano raccolte direttamente su vetrino e colorate con cresil violetto per fungere da riferimento anatomico. Poiché le sezioni intermedie venivano alternatamente processate per la rilevazione degli Ag P- CREB e c-Fos, la differenza tra ogni sezione marcata e il suo più vicino (precedente o seguente) riferimento anatomico poteva essere di 40 o 80 µm al massimo.
Le sezioni destinate al processamento immunoistochimico venivano raccolte free floating in PBSN in piastre per colture cellulari da 12 pozzetti, provviste di reti per un agevole trasferimento nei successivi passaggi, in numero di 4 sezioni per pozzetto. Poiché da ogni cervello si ottenevano 64 sezioni free
floating (equivalenti a 16 pozzetti), 4 piastre (48 pozzetti) corrispondevano a 3
l'agitatore, su cui le sezioni venivano tenute in costante moto oscillatorio, per cui ogni gruppo di 6 animali veniva processato nel corso di 2 successive sessioni sperimentali. L'assegnazione dei cervelli alle piastre, quindi l'ordine di taglio, era casuale. Un pozzetto per ogni animale era assegnato, anch'esso in maniera casuale, al controllo corrispondente all'Ac anti-c-Fos (NRS) ed uno al controllo corrispondente all'Ac anti-P-CREB (Rabbit IgG). Entrambi venivano definiti
bianchi, in quanto privi di Ac primario e quindi di rilevazione colorimetrica
dell'Ag d'interesse.
Terminata la fase di taglio, le sezioni venivano sottoposte a 4 lavaggi di 10 min, i primi due in PBSN, i due seguenti in PBSNT (Tabella 1) e poste a preincubare a 4°C in blocking solution (NGS 10%, latte commerciale in polvere 2%, BSA 1% in PBSNT), in attesa della tappa successiva. Le sezioni venivano quindi trasferite in piastre da 24 pozzetti, riempiti con 880 µl di Ac primario, grazie a comuni pipette Pasteur, con estremità sottile lavorata a fiamma in modo da ottenere un uncino a punta arrotondata. Questo avveniva il mattino del giorno seguente per l'Ac anti-c-Fos e 24 h dopo per l'Ac anti-P-CREB, in modo da terminare l'incubazione di tutte le sezioni contemporaneamente. Ricordiamo che le diluizioni anticorpali venivano effettuate in PBSN contenente un 1% di NGS ed erano le seguenti: Ac anti-c-Fos, 1:20000; Ac anti-P-CREB, 1:1000; NRS, 1:20000. Per quanto concerne le Rabbit IgG, essendosi queste rivelate non stabili a -20°C (infatti, a distanza di due anni dal congelamento delle aliquote, la diluizione di 1 µg/ml iniziava a produrre una colorazione di fondo scura), si è deciso di ritornare alla diluizione scelta empiricamente nelle prime prove sperimentali di 0,25 µg/ml. Dopo 72 e 48 h di incubazione rispettivamente, a 4°C, le sezioni venivano trasferite nuovamente in piastre da 12 pozzetti dotate di reti, per i successivi 3 lavaggi di 10 min in PBS. Venivano quindi incubate per 30 min al riparo dalla luce in H2O2 allo 0,3% in metanolo 70% in PBS e successivamente
lavate in PBS, 2 volte per 5 min e 2 per 10 min. Di nuovo le sezioni erano trasferite in piastre da 24 pozzetti, riempiti con 830 µl di Ac secondario diluito 1:200 in PBS con l'aggiunta di un 2% di NGS e incubate a TA per 2 h. Seguivano 3 lavaggi in PBS, dopo i quali le sezioni venivano incubate a TA per 2 h in 830 µl
di reagente ABC (A:B:PBS = 1:1:100), preparato almeno 30 min prima, sempre previa trasferimento in piastre da 24 pozzetti. Seguivano 3 lavaggi di 10 min in PBS e 2 sempre di 10 min in TB. Infine, le sezioni venivano incubate in DAB allo 0,05% in TB, poi trasferite nella medesima soluzione con l'aggiunta di H2O2 allo
0,01% e lasciate sviluppare per 4 min. Dopo 3 lavaggi di 10 min, le sezioni erano conservate a 4°C in attesa di essere montate su vetrino. Dopo il montaggio, venivano lasciate asciugare tutta una notte, immerse in H2O bidistillata per 10
min, quindi disidratate per successivi passaggi di 5 min in una scala crescente di alcool: etanolo 20%, etanolo 50%, etanolo 70%, etanolo 90%, etanolo 100%, etanolo 100%; dopo altri 2 passaggi di 5 min in xilene, venivano apposti i vetrini coprioggetti in DPX.
Al fine di evitare qualsiasi possibilità di errore e confusione durante la serie di lavaggi e trasferimenti, ogni piastra da 12 pozzetti era contrassegnata al momento del taglio con un numero in codice colore posto in corrispondenza delle reti. Le piastre da 24 pozzetti, orientate verticalmente (4 x 6), corrispondevano ognuna a due piastre da 12 (4 x 3) orientate orizzontalmente, che venivano riportate graficamente su di esse rispettando il codice colore. Per l'incubazione in Ac primario, i bianchi erano anch'essi contrassegnati appositamente. Anche ai vetrini è stato assegnato un codice colore: banda gialla per l'Ag c-Fos, arancio per l'Ag P-CREB, verde per il NRS, rosa per le Rabbit IgG e blu per il cresil violetto. Tutti i vetrini processati per l'immunoistochimica erano siglati con un codice che permetteva di identificare in maniera inequivocabile l'animale di provenienza, senza tuttavia riportare la condizione sperimentale, in modo da poter condurre in cieco le operazioni di analisi. La sigla, scritta con inchiostro resistente ai solventi (penne per cassette resistenti ai solventi Securmark II, Bio-Optica), era composta dal numero del blocco sperimentale, seguito da una lettera (F, c-Fos; P, P-CREB; C per i bianchi), dal numero della piastra di assegnazione dell'animale (da 1 a 6), poi dalle coordinate del pozzetto e infine dal numero progressivo della sezione. Alcuni esempi sono riportati qui di seguito: 28 F5D4 19, 30 C3A2 2, 31 P2B1 46 o 29 C6C3 73. I vetrini anatomici, colorati con cresil violetto, venivano siglati con numero dell'esperimento e della piastra (che insieme identificavano un singolo
animale), data di taglio e numero progressivo della sezione, per esempio: 28 1
190106 25.