4.3 Metodi di analisi
5.1.1 Gel Casting Inorganico
Il primo materiale analizzato è il biovetro 47.5b, materiale già spesso utilizzato per scaffold e testato, con il metodo del robocasting, nei lavori di Baino et al. [10, 11]. Questo materiale, in con-fronto al biovetro 45s5 sviluppato da Hench [63] possiede un’ampia finestra di sinterizzazione, la
Figura 5.1.1: Temperature di transizione per biovetro 47.5b [11]
composizione modificata permette infatti di avere (𝑇𝑥 − 𝑇𝑔 = 260∘𝐶). La Temperatura di sinte-rizzazione, per questo materiale è stata scelta di 600 °C, sempre facendo riferimento al lavoro di Baino et al.
Una serie di prove sono state effettuate in modo da individuare la migliore combinazione di parametri per la percentuale di massa di solido (range: 60-70%) e il tempo di curing post attiva-zione / pre schiumaggio (range 0-2h). In generale, una percentuale di solido più alta produce uno scaffold dalla porosità più piccola e meno aperta; un tempo di curing troppo basso rende difficile uno schiumaggio adeguato, data la bassa viscosità della malta vetrosa. La viscosità della miscela infatti, aumenta principalmente durante il curing. I risultati migliori sono stati ottenuti con il 60% di contenuto solido in miscela e con 2h di curing, in un contenitore chiuso (per non perdere umidità), a 40°C.
Le immagini microscopiche in figura 5.1.2 successive mostrano la morfologia della schiuma vetrosa ottenuta alle condizioni di cui sopra.
La sinterizzazione è stata eseguita con trattamento termico a 600 °C ( appena sopra 𝑇𝑔ma molto distante da 𝑇𝑥in modo da evitare cristallizzazione) con dwelling time di 1h, heating rate di 1°C/min e tre step a 200, 400, e 500 °C in modo da favorire l’espulsione di tutta la frazione organica data dal tensioattivo. Le immagini al microscopio in figura 5.1.3 mostrano lo scaffold post sinterizzazione.
Come si può osservare, lo scaffold post sinterizzazione presenta una colorazione tendente al nero. L’identificazione della fase che porta questa colorazione è ancora in esame, si presume sia dovuta alla presenza di carbonio da pirolisi del surfattante, intrappolato all’interno del gel. A livello fisico e morfologico la presenza di questa fase non comporta particolari ripercussioni. L’effetto a livello biologico dovrà essere valutato ma non è oggetto di questa tesi, anche se sono presenti in
5.1. BIOVETRO 47.5B 63
Figura 5.1.2: Immagini al microscopio ottico di scaffold ottenuto con Biovetro 47.5b, attivazione con NaOH, schiuma verde, pre sinterizzazione
Figura 5.1.3: Immagini al microscopio ottico di scaffold ottenuto con Biovetro 47.5b, schiuma sinterizzata
Figura 5.1.4: a sinistra, Immagine binarizzata dell’ingrandimento minore di figura 5.1.2, a destra, grafico della distribuzione della porosità normalizzata con l’area.
letteratura dei dati che mostrano come la presenza di carbonio pirolitico non sia un aspetto dannoso per la bioattività ma, al contrario, possa stimolare la compatibilità dello scaffold [36].
La struttura porosa è stata analizzata al picnometro e tramite un software di analisi di immagini ’ImageJ’. Il software aiuta a fornire una stima della dimensione dei macro-pori e delle interconnes-sioni, tramite la misura delle aree bianche in un’immagine binarizzata, in figura 5.1.4. La binariz-zazione si ottiene aumentando il contrasto dell’immagine, degli strumenti nel software permettono di dividere la parte nera (pareti della schiuma) dalla parte bianca (pori), dopo che sia stato settato in modo adeguato a mano dell’operatore un threshold1 che divide porosità da pareti. La distribuzione dei diametri della porosità è rappresentata poi, normalizzando la distribuzione dei raggi in base al-l’area. In questo modo, ogni barra rappresenta la frazione di area superficiale occupata da una certa dimensione dei pori.
Come si osserva dall’immagine 5.1.4, la distribuzione della porosità è ampia e presenta un mas-simo per i pori di diametro 500𝜇𝑚, mantenendo però una buona quantità tra 20𝜇𝑚 e 100𝜇𝑚, e di dimensioni superiori, che si avvicinano al millimetro.
L’analisi al picnometro ha riportato una porosità totale 𝜙𝑡𝑜𝑡= 77%, una porosità aperta 𝜙𝑜𝑝𝑒𝑛 = 74, 3% e una porosità chiusa del 𝜙𝑐𝑙𝑜𝑠𝑒 = 2, 6%.
1I treshold sono stati impostati in modo conservativo, considerando anche parte della porosità effettiva appartenente alla parete, tutte le misure effettuate con questo metodo forniscono quindi una stima della dimensione media dei pori inferiore a quella che si troverebbe utilizzando ad esempio la microtomografia. In questo modo si può avere un certo margine di sicurezza, affermando che i pori siano ’almeno’ delle dimensioni indicate nei grafici.
5.1. BIOVETRO 47.5B 65
Figura 5.1.5: confronto tra spettri FTIR della schiuma a base di biovetro 47.5b, dall’alto in basso: post sinterizzazione (47.5bX4a fired), verde (47.5bX4a) e materiale originario come ricevuto (47.5b as received)
I dati ottenuti da queste prove, in accordo con i requisiti illustrati nel paragrafo 3.1 confermano che le qualità morfologiche ottenute in questo tipo di schiuma sono adatte per l’ottenimento di uno scaffold per l’ingegneria tissutale.
Come è possibile notare da quanto mostrato in figura 5.1.5, lo spettro FTIR mostra alcune bande presenti solo nella fase attivata (verde) e non nel sinterizzato e nel vetro di partenza; le bande presenti tra 3000-3700 e 1650 𝑐𝑚−1 sono attribuibili all’idratazione del biovetro 47.5b (O-H stretching e bending), è presente un indicazione del legame C-O, tra 1450 e 1500 𝑐𝑚−1, possibile contributo di carbonati formati nell’indurimento. Il surfattante è visibile nella banda a 2900 𝑐𝑚−1. I picchi che si trovano a numeri d’onda compresi tra 1050 e 950 𝑐𝑚−1sono dovuti ai legami degli ossigeni pontanti con gli atomi di silicio o di alluminio.
Figura 5.1.6: confronto tra spettri XRD della schiuma a base di biovetro 47.5b, dall’alto in bas-so: post sinterizzazione (47.5bX4a), verde (47.5bX4a, green) e materiale originario come ricevuto (47.5b non processed)
Nello spettro XRD in figura 5.1.6 si conferma che il vetro rimane quasi totalmente amorfo durante la sinterizzazione. Nel verde si osservano alcuni picchi di diversi composti contenenti sodio, possibile effetto dell’attivatore NaOH e la conferma della formazione di alcuni carbonati idrati.
5.1. BIOVETRO 47.5B 67