In Tabella 3.2 sono riportati i risultati per i tre complessi utilizzati nel seguito della tesi. Come si vede, i valori di RMSD sono sotto i 10˚A, pi`u di quanto ci si aspetterebbe per
P DB RMSD (˚A) Q
1JPS 5.471 5.0
1V7M 9.095 12.0
1MLC 8.371 12.0
Tabella 3.2: Gli RMSD ottenuti per la miglior posa nella validazione dell’algoritmo di docking.
una posa realistica ma sufficienti a garantire che la posa selezionata `e molto vicina a quella nativa e dunque l’algoritmo coglie le caratteristiche geometriche essenziali che determinano la complementarit`a nel docking.
3.2
Generazione del database di regioni di complementariet`a
Il fine del nostro lavoro `e riuscire a dare informazioni utili su quale delle strutture canoniche `
e la pi`u promettente per legare un determinato antigene; come detto nell’introduzione non verr`a indagato il ruolo di H3, che, come si vede dalla Tabella 1.3, presenta una variabilit`a troppo alta. Per quanto riguarda gli altri loop, facendo riferimento alla Tabella 1.2, ci sono un totale di 6×1×6×4×6 = 864 possibili combinazioni di strutture canoniche, e ciascuna di esse andr`a testata in un docking con l’antigene per determinare quale combinazione offre la maggiore complementariet`a; questo aggiunge un fattore 103 al tempo che sarebbe richiesto per valutare un singolo docking, e rende ragione della necessit`a di un algoritmo di docking molto veloce.
3.2.1 Creazione del database
La generazione del database `e stata eseguita tramite programmi realizzati in Python. Questo linguaggio `e stato scelto poich´e presenta una gestione pi`u semplice delle stringhe, molto utile al fine di maneggiare file PDB, e poich´e cos`ı facendo `e stato possibile implementare molto semplicemente gli algoritmi per il calcolo dell’RMSD sviluppati da Bosco Ho (http: //boscoh.com/protein/matchpy), che sono appunto realizzati in Python.
Il database da cui si `e attinto per la generazione `e quello realizzato dal gruppo della Prof.ssa Tramontano presso l’universit`a La Sapienza di Roma (descritto in [10]), che con- tiene, oltre alle informazioni nelle tabelle 1.2 e 1.3, una grande quantit`a di codici PDB di anticorpi classificati secondo le strutture canoniche a cui appartengono i loro loop, e la loro sequenza. Poich´e tra le strutture classificate in questo database `e presente almeno un PDB per ogni struttura canonica di ogni loop, `e stato possibile ottenere una libreria di
loop semplicemente scaricando i PDB relativi dal Protein Data Bank ed estraendo dalle strutture le coordinate dei loop, identificati tramite allineamento della sequenza, scartando poi le strutture che non rispettavano i vincoli riportati nella Tabella 1.2. Per ogni loop sono state salvate anche le coordinate dei quattro residui precedenti e dei quattro seguenti. Per ogni struttura canonica di ogni loop si sono ottenute in questo modo decine di candidati, e per L2, per il quale `e presente una sola struttura canonica, erano presenti addirittura 188 cristalli.
A questo punto, una volta scelto un anticorpo da cui prelevare la struttura di base, detta framework, per ciascun loop si `e effettuato un best fit minimizzando l’RMSD degli otto residui intorno al loop (quattro precedenti e quattro seguenti) tra il framework e la libreria; per ogni struttura canonica `e stato scelto il candidato loop con il minor RMSD. Durante la minimizzazione `e stato dato un peso maggiore ai residui pi`u lontani dal loop; gli RMSD ottenuti sono stati in tutti i casi inferiori a 1˚A, il che indica una buona sovrapposizione, come ci si aspettava data la natura conservata della struttura delle immunoglobuline3. In
figura 3.10 sono riporati alcuni esempi di anticorpi ottenuti con questo metodo.
Figura 3.10: Alcuni anticorpi del database combinatoriale ottenuti utilizzando l’algoritmo descritto qui sopra a partire da un framework comune, preso dal PDB 1MLC.
Poich´e il loop H3 del framework non viene sostituito, il database di anticorpi ottenuto eredita quello del framework. Questo pu`o essere sfruttato a proprio favore: quando si vuole trattare un antigene di cui `e disponibile il complesso con un anticorpo `e possibile utilizzare come framework proprio l’anticorpo preso dal complesso, in modo che tale loop non presenti ingombri sterici particolari e non sia perci`o di intralcio.
Per indicare una particolare combinazione di strutture canoniche si utilizzer`a la nota- zione L1.L2.L3.H1.H2.
3La buona sovrapposizione `e stata verificata anche visivamente tramite il porgramma VMD, che inter-
pretava correttamente i legami tra i residui del framework e dei loop incollati. Ci`o indica che non ci sono distanza di legame innaturali nelle strutture finali.
3.2 Generazione del database di regioni di complementariet`a 89
3.2.2 Coarse-graining dei loop
I loop ottenuti nella sezione precedente sono presi direttamente dai file PDB di originale appartenenza, e contengono le coordinate esplicite di tutti gli atomi di ogni residuo. Noi non vogliamo questo livello di dettaglio, poich´e per ora siamo interessati a fare una previsione solo sulla struttura geometrica del backbone e non sull’esplicita sequenza amminoacidica. Per fare ci`o si `e deciso di sostituire gli amminoacidi sui loop con sfere aventi un raggio medio. Quale raggio bisogna assegnare? Qual `e il raggio medio di un amminoacido? Ovviamente la domanda, posta in questi termini, non ha senso: il raggio di un amminoacido non `e ben definito, anche perch´e le catene laterali sono molto flessibili.
Ai fini dell’algoritmo, tuttavia, ci`o che interessa `e solo la superficie molecolare: `e su tale base che la nostra rappresentazione pi`u grezza (coarse grained ) va valutata. Per fare ci`o abbiamo sostituito tutti gli amminoacidi sui loop del database di anticorpi con delle sfere centrate sul carbonio α, per raggi di alcuni ˚A a passi di 0.1˚A, e abbiamo calcolato la superficie molecolare, ottenuta con DelPhi, discretizzata come detto su una griglia di passo 0.5˚A. Il risultato `e sorprendentemente omogeneo: il raggio che minimizza la differenza tra la superficie con gli atomi espliciti e quella coarse-grained `e quasi in ogni caso r = 2.5˚A (Fig. 3.11), con percentuali di identit`a intorno al 99.5%.
Figura 3.11: L’istogramma dei raggi che massimizzano l’identit`a tra le superfici molecolari: in ascissa il raggio, in ordinata il numero di strutture. Non `e stato necessario rifinire la ricerca, perch´e a causa delle approssimazioni coinvolte nella parte successiva del programma di docking anche un passo di 0.1˚A `e sufficientemente fine.
Questo ci fornisce buone ragioni per assumere che questa approssimazione non sia troppo drastica. Gli amminoacidi sui loop sono stati dunque sostituiti con sfere di raggio r = 2.5˚A, `
e stata calcolata la superficie molecolare e sono stati calcolati i coefficienti di proiezione (Eq. 3.2) del database di anticorpi col metodo descritto nella sezione precedente; a questo punto il database `e pronto per essere utilizzato nell’algoritmo di docking.