Hek Blue hTLR7

Le Hek Blue hTLR7 sono state ottenute dalla cotrasfezione, nelle cellule HEK 293, del gene umano hTLR7 (a cui devono il loro nome), e di un

gene reporter che codifica per l'enzima SEAP (Secreted Embryonic Alkaline Phosphatase). Poichè le Hek293 esprimono livelli endogeni solo di TLR3 e di TLR5, nelle cellule hTLR7, l'introduzione del gene hTLR7 garantisce l'espressione anche dei TLR7. Per questo motivo, le Hek Blue hTLR7 sono particolarmente valide per lo studio dei meccanismi coinvolti nella segnalazione e nel riconoscimento del recettore, andando a monitorare l'attivazione dell'NF-kB (fattore di trascrizione nucleare).

Figura 19: Pathways dei TLR7, in cui attivano la migrazione dell'NF-kB nel nucleo

Il recettore TLR7 è filogeneticamente vicino al TLR8 e TLR9 ed è importante in quanto riconosce piccole molecole sintetiche come le loxoribine e gli R848, composti imidazoquinolini. Una volta attivato, il recettore induce la produzione dell'IFN-alfa, TNF-alfa e IL-12; inoltre, alcune sequenze di ssRNA (single-stranded RNA) sono state identificate come ligandi naturali del TLR7, tra cui sequenze derivate

dall'HIV-1 o dal virus dell'influenza, in quanto vanno ad indurre la produzione di citochine proinfiammatorie.

I TLR7 sono dei recettori che fanno parte della famiglia di Toll-like Receptors, tale famiglia è costituita da circa 12 diversi recettori, espressi in maggior quantità dalle cellule del sistema immunitario come i macrofagi, le cellule dendritiche e i monociti170_{. Questi recettori}

possono essere classificati in diverse sottofamiglie in base alla loro localizzazione cellulare e al tipo di ligando che riconoscono, tra cui il riconoscimento dei pattern molecolari associati al patogeno (PAMPs) e dunque giocano un ruolo principale nell'attivazione dell'immunità innata e adattativa171_{, la quale entra in funzione se l'infezione è più}

grave, usando anticorpi costruiti su misura e la forza distruttiva dei globuli bianchi per combattere gli invasori.

I recettori Toll-like1, -2, -4, -5 e -6 sono localizzati sulla superficie cellulare e legano principalmente componenti microbiche di membrana, come, ad esempio, lipidi, lipoproteine e proteine.

Mentre i TLR3, -7, -8, -9, coinvolti nel riconoscimento di strutture, come acidi nucleici di virus e batteri, si ritrovano quasi esclusivamente in compartimenti intracellulari, come endosomi, reticolo endoplasmatico, lisosomi e endolisosomi172_{. La particolare}

localizzazione intracellulare è di fondamentale importanza per impedire reazioni autoimmuni, poichè, come abbiamo già detto i loro ligandi principali sono costituiti da acidi nucleici virali o batterici, quindi per poter essere attivati. C'è bisogno che il materiale genetico estraneo sia veicolato all'interno della cellula ospite. Al contrario, gli acidi nucleici presenti nell'ambiente extracellulare, essendo rapidamente degradati dalle nucleasi, non possono raggiungere i compartimenti intracellulari. Di conseguenza viene impedito il riconoscimento da parte dei TLRs degli acidi nucleici "self", evitando così l'insorgenza di patologie autoimmuni173_.

Infine, in seguito al riconoscimento del rispettivo ligando, vengono attivate cascate di trasduzione del segnale che portano ad un aumento dell'espressione di geni coinvolti nella risposta immunitaria. In particolar modo, viene stimolata la secrezione di citochine (INF-alfa, TNF-alfa), la fagocitosi e l'attività citolitica delle cellule natural killer174_.

Più in dettaglio la cascata di segnali è causa di una cambiamento conformazionale del recettore, infatti, come molti recettori della membrana cellulare, i Toll-like receptors trasmettono i loro segnali alla cellule formando un dimero.

Figura 20: Alcune vie di segnalazione dei Toll-like receptors

Il recettore attraversa la membrana cellulare, infatti è formata da una grande porzione a ferro di cavallo nella parte esterna della cellula e da un piccolo dominio con attività chinasica nella parte interna. La molecola del patogeno, in questo caso un lipopolisaccaride (rosso in

figura), viene catturata dalla proteina (color verde) formando un

complesso che poi lega insieme due copie della porzione a ferro di cavallo che si trovano sul lato esterno della membrana. La formazione del dimero, a questo punto, attiva il dominio chinasi ed innesca la cascata di segnali all'interno della cellula che producono la risposta infiammatoria.

Figura 21: Struttura a ferro di cavallo del TLR7.

La struttura dei Toll-like receptors, quindi, è caratteristica, in quanto forma un ferro di cavallo, formato da una sequenza di amminoacidi ripetuti, chiamata ripetizione ricca di leucina. Questo motivo è presente anche in altre proteine, in particolare in quelle che legano altre proteine.

In alcuni casi, come nell'inibitore della ribonucleasi, la proteina si lega proprio dove sembra più logico, all'interno della struttura a ferro di cavallo. In generale, però, in questi recettori le molecole bersaglio si legano in una tasca che si trova sul un lato del ferro di cavallo. Questo è evidente soprattutto nei recettori Toll-like che riconoscono lipoproteine batteriche come quello mostrato in figura 4, dove si vede che le catene lipidiche della molecola bersaglio (sfere grigio chiaro) sono inserite in due profonde tasche che si trovano nelle zone del recettore che si devono avvicinare per formare il dimero175_.

Figura 22: Legame molecole bersaglio (sfere grigio chiaro) nelle tasche del Toll-like receptors.

Il pathway di segnalazione è sfruttato anche dal gene reporter SEAP, cotrasfettato nelle cellule hTLR7. In particolar modo, il gene che codifica per la forma secreta della fosfatasi alcalina embrionale, viene posto sotto il controllo del promotore del gene dell'INF-beta, combinato con cinque siti di legame per i fattori trascrizionali NF-kB e AP-1. Infatti, la stimolazione dei TLR7 con specifici ligandi si traduce nell'attivazione dei due fattori trascrizionali sovracitati e nella trascrizione del gene reporter SEAP, la cui quantificazione è diventata uno strumento vantaggioso nell'impiego di una grande quantità di applicazioni come gli studi sulla funzione dei promotori genici e sulle analisi di espressione genica.

SEAP codifica una forma tronca della fosfatasi alcalina placentare umana (PLAP) in quanto priva del dominio di ancoraggio della membrana. Per questo motivo, la proteina SEAP viene efficientemente secreta dalle cellule hTLR7 nel supernatante della coltura cellulare, offrendo diversi vantaggi rispetto ai reporters intracellulari, inoltre l'interferenza delle fosfatasi alcaline endogene è molto bassa in un terreno di coltura176_.

l'attività della SEAP mediante un kit (HEK-Blue Detection), fornito sempre da Invivogen.

L'HEK-Blue Detection non solo contiene i nutrienti necessari per favorire la crescita cellulare, ma presenta un substrato cromogeno specifico per la forma secreta della fosfatasi alcalina embrionale. Infatti, se le cellule crescono secernono la SEAP, la quale idrolizzerà il substrato, conferendo al terreno un colore tendente al rosa/blu, a questo punto è stato possibile osservare l'espressione dell'enzima ad occhio nudo in tempo reale o misurata con uno spettrofotometro (con assorbanza tra i 620-655 nm). Questo è ancora più importante in quanto rappresenta un metodo indiretto per la valutazione dei TLR7, poichè i livelli della SEAP calcolati con il kit sono direttamente proporzionali alla concentrazione intracellulare degli mRNA dell'enzima, quindi ciò corrisponderà ad un aumento dei TLR7 funzionalmente attivi, in quanto recettori a monte della cascata di attivazione.

Per concludere la descrizione delle HEK-Blue HTLR7, nel corso della sperimentazione è necessario utilizzare delle linee cellulari di controllo per essere certi che un determinato ligando vada ad attivare in maniera specifica i recettori TLR7, dato che queste cellule possono essere stimolate da una grande varietà di fattori.