Identificazione malattie virali nella Vite del Fantini

L’individuazione degli agenti virali presenti sui campioni prelevati della Vite del Fantini è stata effettuata mediante reazione di trascrizione inversa abbinata alla reazione a catena della polimerasi (reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR), impiegando appropriate coppie di primers (Tabella 3).

Virus Primer Sequenza (5’-3’) Prodotto

(bp) Riferimenti bibliografici GVA GVA6591F GVA6862R GAGGTAGATATAGTAGGACCTA TCGAACATAACCTGTGGCTC 271 Goszczynski et al., 2003 GVB H28 C410 GTGCTAAGAACGTCTTCACAGC ATCAGCAAACACGCTTGAACCG

459 Minafra and Hadidi, 1994 GLRaV-1 LR1-HSP70-149f LR1-HSP70-293r ACCTGGTTGAACGAGATCGCTT GTAAACGGGTGTTCTTCAATTCTCT 168 Osman et al., 2008 GLRaV-2 P19qtF4 P24qtR CTAACAATTTCTTCTTTGGATCGCAT AGAATGTCTTCAGCTTCATAAGGAG 155 Beuve et al., 2007 GLRaV-3 56F 285R AAGTGCTCTAGTTAAGGTCAGGAGTGA GTATTGGACTACCTTTCGGGAAAAT 254 Osman et al., 2008 GLRaV-4 LR4 hsp-85f LR4 hsp-178r ATATACATACCTTTCGGGAAAAT CCCTATAAACTAGCACATCCTTCTCTAGT 93 Osman et al., 2008 GLRaV-5 26f 188r AACACTCTGCTTTTCTGCTGGC CTTTTTATGTCCCGATAAACGAGTACA 162 Osman et al., 2008 GLRaV-9 LR9-114f LR9-196r CGGCATAAGAAAAGATGGCAC TCTTTATGTCACGGTAGACCAACAC 82 Osman et al., 2008

ArMV/ GFLV M2 M3 (C/T)T(A/G)GATTTTAGGCTCAATGG TG(C/T)AA(A/G)CCAGG(A/G)AAGAAAAT 290 Gambino et al., 2008 GFkV FkV1 FkV2 AGTACCTCCTCCACCGCACC TTTCTCGGGCAGAGAGCCGTCC 243 Sabanadzovic et al., 1996 GRSPaV RSP13 RSP14 GAG GGT CCA GTT GTT TCC ATC CAA AGG ACC TTT TGA CC

314 Meng et al., 1999 GPGV GPgV F4 GPgV r4 GGCCGTTCACTTATGTCTGA CTCCTGACGAATCGACATATCTTCC 155 Beuve et al., 2007

Tabella 3: Coppie di primers utilizzate per la determinazione dello status sanitario delle vite saggiate

Nello specifico, sono state svolte le analisi per l’individuazione dei i seguenti virus: Grapevine

leafroll-associated virus 1, 2, 3, 4, 5, 9 (GLRaV-1, 2, 3, 4, 5, 9), Grapevine virus A (GVA), Grapevine virus B (GVB), Grapevine fanleaf virus (GFLV), Arabis mosaic virus (ArMV), Grapevine fleck virus

(GFkV), Grapevine rupestris stem pitting associated virus (GRSPaV), Grapevine pinot gris virus (GPGV).

3.8.1 Estrazione acidi nucleici dai tessuti vegetali

L’estrazione degli RNA virali è stata effettuata dal tessuto fogliare della Vite del Fantini. È stato utilizzato lo SpectrumTM _{Plant Total RNA kit (SIGMA), modificandone leggermente il protocollo.}

Un campione di 1 g di tessuto fogliare è stato omogeneizzato in buste di estrazione (Bioreba), utilizzando un apposito trapano, dopo avere aggiunto 7 ml di tampone MacKenzie di estrazione, con forti proprietà denaturanti e distruttive nei confronti delle cellule:

- 4 M guanidina isotiocianato; - 0,2 M sodio acetato (pH 5);

- 25 mM NaEDTA (etilendiaminotetracetato di sodio); - 2,5% (w/v) PVP-40 (polivinilpirrolidone).

A 1 ml della sospensione ottenuta, trasferita in un tubo Eppendorf da 1,5 ml, sono stati aggiunti 150 µl di sodiolaurilsarcosina al 30%, che ha la funzione di denaturare le proteine; il tutto è stato incubato a 70°C per 10 minuti e poi centrifugato per cinque minuti a13.000 rpm.

Terminata questa fase, seguendo il protocollo del kit, sono stati impiegati i seguenti componenti:

- “Filtration Columns” (blu): le colonnine trattengono i frammenti delle cellule sottoposte in precedenza a lisi consentendo l’omogeneizzazione del campione;

- “Binding Columns” (rosse): le membrane di gel di silice, presenti nelle colonnine, legano gli acidi nucleici estratti (DNA+RNA) che sono poi facilmente eluibili con acqua;

- “Soluzioni di lavaggio 1 e 2”: tamponi di lavaggio contenenti etanolo per la rimozione di metaboliti e composti cellulari.

Il volume totale è stato trasferito in una “Filtration Column”, posta in un tubo Eppendorf da 2 ml (“collection tube”, fornito dal kit), e centrifugato a 13.000 rpm per cinque minuti. Questo passaggio permette di rimuovere la maggior parte dei residui cellulari; tuttavia, una piccola quantità degli stessi può passare attraverso la membrana della colonna e formare un piccolo sedimento (pellet) sulla base della provetta. Questa fase può essere ripetuta due volte, a seconda del volume iniziale.

L’eluato è stato trasferito in un nuovo tubo Eppendorf (da 1,5 ml, non fornito dal kit) a cui sono stati aggiunti 350 µl di etanolo al 70%; 700 µl della miscela sono stati posti in una “Binding Column”, inserita in un “collection tube”, centrifugando a 13.000 rpm per 1 minuto. Eliminato l’eluato, il procedimento è stato ripetuto una seconda volta, utilizzando la quantità rimasta.

L’acido nucleico, legato alla “Binding Column”, è stato quindi lavato con 500 µl di tampone di lavaggio 1 e centrifugato a 13.000 rpm per 1 min. In seguito, la colonnina è stata lavata 2 volte con 500 µl di tampone di lavaggio 2 e centrifugata a 14.000 rpm per 1 min. Infine è stata centrifugata nuovamente “a vuoto” per 3 min, con l’intento di eliminare ogni residuo di etanolo che potrebbe inibire le reazioni successive.

Infine, l’RNA totale è stato eluito con 100 µl di acqua RNase-free, centrifugando a 13.000 rpm per 1 minuti. L’RNA così ottenuto è stato conservato a –20°C.

3.8.2 Reazione di trascrizione inversa (RT) abbinata alla reazione a catena

della polimerasi (PCR)

I campioni di RNA estratti e i controlli positivi e negativi sono stati centrifugati a 4°C per 10 min (per ridurre la concentrazione degli inibitori presenti) e sottoposti a retrotrascrizione (RT, reverse

transcriptase), che consente la sintesi di un filamento di DNA complementare (cDNA) sullo stampo

È stato utilizzato 0.5 µL di RNA, a cui sono stati aggiunti 4,5 µL della miscela: - M-MLV RT 5X Buffer (Promega) 1,0 µl

- Random primers (0,5 µg/µl; Roche) 1,0 µl

- dNTPs (10 mM; Promega) 0,5 µl - M-MLV RT (20 U/µL, Promega) 0,25 µl

- H2O RNasi-Free 1,75 µl

La reazione è avvenuta, in Thermostrip da 0,2 ml (Micro Biotech), a 42°C per un’ora, seguita da una fase a 94°C per 15 min, per inattivare l’enzima.

I campioni sono stati quindi sottoposti alla reazione a catena della polimerasi (PCR, polymerase chain

reaction) con amplificazione del frammento ad opera dell’enzima Taq polimerasi, impiegando il

termociclatore Thermocycler Biometria T3. Ai 5 µl di reazione di RT, sono stati aggiunti 20 µl della miscela di PCR così composta:

- Free Mg 5x Buffer (Promega) 5,00 µl - MgCl2 (25 mM; Promega) 1,50 µl - dNTPs (10 mM; Promega) 0,50 µl - Primer omologo o “forward” (10µM) 1,00 µl - Primer complementare o “reverse” (10µM) 1,00 µl - Go Taq Flexy polimerasi (5U/ µL; Promega) 0,25 µl

- H2O RNase-Free 10,8 µl

Il ciclo di PCR prevede:

- denaturazione a 95°C per 10 sec;

- annealing per 10 sec a T°C variabile a seconda del virus analizzato (tab.7); - sintesi a 72° per 45 sec.

Queste fasi sono state ripetute 35 volte.

Otto microlitri dei prodotti ottenuti dalla reazione RT-PCR sono stati analizzati tramite elettroforesi in gel di agarosio all’1% in TBE 1X (500 ml di TBE 10X contengono 54 g Tris-base, 27,5 g acido borico e 20 ml di 0,5 M NaEDTA pH 8,0) impiegando la cella elettroforetica MIDI HU13 (ANALYTICAL CONTROL). Terminata la corsa, il gel è stato colorato in una soluzione 0,4 µg/ml di bromuro di etidio e i frammenti di DNA sono stati evidenziati mediante un transilluminatore a luce UV (Spectroline, Model TVL-312A). Il peso molecolare dei prodotti di PCR è stato stimato confrontandone la mobilità con frammenti di DNA noti (100 bp DNA Ladder, Promega).

3.9 Trattamento in endoterapia

Dopo aver analizzato le colonie fungine e svolto le prove in vitro con i prodotti RESOLV 5, FI PLUS ed ES PLUS, sono stati eseguiti due trattamenti in endoterapia utilizzando il prodotto RESOLV 5 e ES PLUS. Tali prodotti, infatti, avevano mostrato nelle prove in piastra degli ottimi risultati nel contenimento della crescita del patogeno fungino analizzato. Il prodotto RESOLV 5 è stato utilizzato nel primo trattamento ad una concentrazione del 0.2%, mentre nel secondo trattamento è stato utilizzato il prodotto ES PLUS (0.2%).

Il trattamento è stato effettuato alla pressione di 4 bar per circa 30 minuti.

Nella Figura 13 è possibile osservare i fori effettuati per il successivo trattamento in endoterapia (Figura 14).