Immagini

3.3.1 Acquisizione ed elaborazione delle immagini in luce bianca

Tutte le immagini in luce bianca sono state acquisite utilizzando il microscopio Olympus SZH. La fotocamera istallata su questo microscopio è una Nikon DS-Fi1-U2, gestibile interamente attraverso il software in dotazione: Nis-Elements F3.0. I parametri impostati per tutte le foto scattate con questo strumento si sono attenuti il più possibile ai seguenti:  Format: 2560x1920  Exposure: AE 15ms (+1,6/1,3/1,0 EV)  Gain : 1.00x  Noise Reduction : ON  White Balance : 1.18, 1.00, 2.20  Saturation 0.00  Hue: 0.00  Offset: 0.00  Contrast: Antireflex  Sharpness: Lowest

Tutte le immagini di embrioni dell’età di 24h sono state scattate ad un ingrandimento totale di 40x, mentre tutte le immagini di embrioni di 48h sono state scattate ad un ingrandimento totale di 30x. Non ci si è avvalsi degli strumenti di fotoritocco presenti nel software in dotazione con la fotocamera.

Al fine di migliorare la qualità e l’informatività delle immagini, tutti gli embrioni, prima essere fotografati, sono stati decorionati manualmente ed isolati in una piastra Petri contenente acqua del sistema Tecniplast (indicativamente 30ml) con l’aggiunta di 1ml di Tricaina metansolfonato per annullare i movimenti degli embrioni.

Con l’intento di esaltare la morfologia degli organi e dei tessuti, si è provveduto a prevenire la pigmentazione degli embrioni aggiungendo al mezzo di crescita degli stessi Feniltiourea 0,0003% durante la ventiquattresima ora di vita. In questo modo gli embrioni di 48h risultano quasi del tutto privi di pigmentazione.

L’elaborazione delle immagini ottenute con queste modalità è stata effettuata utilizzando il software open-source GIMP 2 (The GNU Image Manipulation Program, release 2.6.11), tramite il quale si è voluto rendere le fotografie più nitide, pulite e di immediata comprensione, senza alterare in alcun modo il contenuto informativo delle stesse.

3.3.2 Acquisizione ed elaborazione delle immagini tramite microscopia confocale

I risultati degli esperimenti di immunoistochimica “whole-mount” sono stati visionati con l’ausilio del microscopio confocale TCS SP2 AOBS di Leica.

Gli embrioni sono conservati in Eppendorf da 1,5ml immersi in una soluzione di glicerolo 87% e PBST. Per poter passare alla fase di visualizzazione ed acquisizione delle immagini, è necessario:

1. Trasferire gli embrioni comprensivi di tutta la soluzione di glicerolo/PBST in Falcon da 15ml.

2. Aggiungere 10ml di PBST e lasciare in agitazione per 30’ mantenendo gli embrioni al riparo dalla luce

3. Eliminare tutta la soluzione e immettere 10ml di PBST. Lasciare in agitazione per 30’ mantenendo gli embrioni al riparo dalla luce. Al termine del lavaggio, lasciare che gli embrioni si depositino sul fondo delle Falcon.

4. Riscaldare a 35°C una soluzione di Low Melting Agar (BioRad) al 2% in PBS, per il tempo necessario alla totale liquefazione

5. Eliminare tutto il PBST e immettere indicativamente 2ml di Low Melting Agar nelle Falcon

6. Prelevare gli embrioni e l’Agar e stendere il tutto su un vetrino da microscopia 7. Con l’ausilio del microscopio ottico e di uno strumento dalla punta molto sottile,

disporre gli embrioni sul vetrino nella posizione desiderata. Terminare l’operazione prima che l’Agar si solidifichi

8. Attendere la completa solidificazione dell’Agar e porre, sullo strato di Agar contenente gli embrioni orientati, un vetrino coprioggetto

Questa metodica è utile al fine di immobilizzare completamente gli embrioni, cosa strettamente necessaria per acquisire immagini di buona qualità.

Tutte le immagini sono state acquisite con l’ausilio del software Leica Confocal Software, fornito in dotazione. Le lunghezze d’onda di emissione dei laser sono state impostate secondo le direttive della casa produttrice degli anticorpi secondari. Ove utilizzati due anticorpi secondari sui medesimi embrioni, si è preferito acquisire il segnale nei due canali di emissione separatamente, non avvalendosi dello strumento fornito dal software che permette l’illuminazione sequenziale di ciascun piano prima con un laser e poi con l’altro, al fine di evitare una possibile sovrapposizione del segnale e la creazione di artefatti. Le immagini sono state acquisite con un obiettivo 20x ad aria. Si è cercato di mantenere il più possibile gli stessi parametri d’acquisizione per le due fluorescenze, pur proponendosi di ottimizzare la qualità dell’immagine, pertanto alcuni valori sono indicati come range. I parametri utilizzati sono i seguenti:

 Gain per fluorescenza verde: 350-500

 Gain per fluorescenza rossa: 450-550

 Pinhole: 500-600

 Modalità di scansione: Z-wide

 Zoom: 1x

 Numero di scansioni per piano: 1

 Spessore di ciascun piano: 1μm

 Tutti i restanti parametri: impostazioni di default

Le immagini ottenute tramite questo microscopio confocale consistono in una sequenza file immagine della risoluzione di 512x512 pixel, il cui numero corrisponde al numero di piani scansionati per ciascuna fotografia. Esse sono state elaborate attraverso il software gratuito ImageJ (Fiji), in grado di accettare in input la sequenza di file prodotta dal microscopio e di fornire in output l’immagine risultante, calcolata tramite l’algoritmo “Standard Deviation”. Non ci si è avvalsi degli strumenti di fotoritocco forniti da questo software. Le immagini risultanti così prodotte sono bianco e nero, hanno una risoluzione di 512x512 pixel e vengono salvate in 8bit.

La successiva elaborazione grafica è stata compiuta tramite il software open source GIMP 2 (The GNU Image Manipulation Program, release 2.6.11), mediante cui le immagini sono state colorate in falsi colori (corrispondenti in ogni caso all’emissione in fluorescenza degli anticorpi secondari utilizzati). Il software è stato sfruttato principalmente per la ricomposizione di immagini che potessero mostrare l’embrione nella sua interezza, per eliminare il rumore di fondo, aumentare la vividezza dei colori e la nitidezza complessiva, al fine di rendere maggiormente intellegibile il contenuto delle immagini, senza apportare alcuna modifica all’informatività delle stesse.